分子克隆：现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功

yaolinzhang

* C9 c8 ]. P8 r9 j- O5 D9 e$ L( ?  c  u. K! F: K
大家好！我做载体已经有三个多月了，还没做出来，很着急！现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功，但单独空载体做转化能长满平板。连接酶换了三个公司的；温度一般用“16度过夜”，后面又试过“16度4h，4度过夜”及"22度3h",均不成功；胶回收试剂盒也换了两次；另外，载体浓度一般在40ng/ul-90ng/ul之间；片段浓度在30ng/ul-40ng/ul之间；比例按说明书上的载体及靶片段摩尔之比为3:1。我不知道问题出在了哪里？求各位高人指点，多谢！！！

weiyepan

回复 刘森泉 的帖子+ o: J# F  T& P, M

! q- \* q5 h) I- ^4 h. A/ mPCR产物是5'羟基末端，酶切过的地方是5'磷酸末端。
7 @$ t' y. E# H, z0 K, U如果磷酸酶处理过的片段，那5'也是羟基末端。
& |4 f& {; q1 U* {3 P: z9 X连接只能在5'磷酸和3'羟基之间进行。

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子
3 \2 H4 Z9 H5 A" {4 C' d9 J1 i' f
9 g6 ?( ~8 I* g我们的片段是加在T载体上扩增的，然后做的酶切

yaolinzhang

回复 weiyepan 的帖子
& r9 q( s' c( w: i. s9 ~
) [+ z9 D# j5 y非常感谢您的宝贵建议，我明天试试，谢谢！

yaolinzhang

和你差不多，好的

刘森泉

回复 yaolinzhang 的帖子7 W3 F; v8 h) X
! P# q/ I1 V) e" f- [' K: u
你造血是做什么方面的呢？我做多能干向造血分化，以后多交流哈。

刘森泉

回复 weiyepan 的帖子+ S. M/ f2 C( f" [5 t' V; V
. ]) R& d- t! i2 s# |# h
一般载体切完都是跑胶回收的，而且用水溶的。8 J2 c( f) Y* {0 W6 H; s# f8 |0 t
PCR产物是用高保真酶做的，应该会有磷酸末端吧，具体有没有怎么鉴定啊？

weiyepan

回复 yaolinzhang 的帖子4 u+ c- t% q3 O' {. s3 F

) g( Q, d  f+ c- A8 j) c# Y切完载体之后有cleanup过么？" O8 x. Q& b; ^! `4 V& B6 @
T4 ligase对盐浓度比较敏感，如果你使用的高盐的酶切buffer就要先做个cleanup，不要直接在里面连。1 i; B% Z+ Y; v+ Q. ]" N2 }  L& ~
另外可能是有质粒有外切酶污染，建议酶切之前80度煮个10分钟再加酶。* \% T. v+ \( |
最后一个最简单的可能，你片段保证是有磷酸末端的吧？

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子9 L  {- v: w/ ^# `

! ~% o4 j8 Y0 a( ^不好意思，权限限制，不能给你留言

yaolinzhang

回复 刘森泉 的帖子
. P" P9 r  r5 j. ?, P5 @
3 g2 W) a: ~8 v5 J. D我在做造血干，好像你也在做。是吗