分子克隆：现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功

yaolinzhang

' t, t. Q) Y9 W! [1 O5 a7 Y  K: Q1 x2 W  ~0 d
大家好！我做载体已经有三个多月了，还没做出来，很着急！现在问题估计出在了连接上，因为空载体单切自连做转化不成功，但单独空载体做转化能长满平板。连接酶换了三个公司的；温度一般用“16度过夜”，后面又试过“16度4h，4度过夜”及"22度3h",均不成功；胶回收试剂盒也换了两次；另外，载体浓度一般在40ng/ul-90ng/ul之间；片段浓度在30ng/ul-40ng/ul之间；比例按说明书上的载体及靶片段摩尔之比为3:1。我不知道问题出在了哪里？求各位高人指点，多谢！！！

hndxws

不会是酶切位点不匹配吧？不会犯这种错误吧。要不就是引物末端设计错了，可以得到PCR片段，但是这个片段却不能被你用的酶切开，所以就连不上，这是最可能的原因。以你的描述我能想到的原因就这些了。

yaolinzhang

谢谢，但酶切位点都仔细查过了，没有问题；引物也没问题！急呀！

loyal

回复 yaolinzhang 的帖子
' l" u4 ~# f3 Z% `* S: D
; r! o3 e9 m* K; `4 ?黏末端还是平末端连接，载体和片段大小各多大？

yaolinzhang

黏末端，载体7900多，片段1000多一点

loyal

回复 yaolinzhang 的帖子
$ d  {" k" x  I0 x, P( n8 L0 m' u4 L
7 |/ c. ^( t# h( u8 r应该不难吧，酶切位点什么的没搞错吧，那就将片段多切点，多回收点，让它浓度大点，按1:7，16℃过夜试试

yaolinzhang

这个也试过了，不行，压力好大！

yaolinzhang

我转化做了近20次了，除了空载体外，其他都不长；温度，感受态，浓度，比例，试剂均做过不同的调整，还是一样没结果，郁闷，牛人帮忙

c05241037

你的连接酶有没有问题？载体自连不成功的话，双酶切连接更难成功。; E/ G# ~9 ^: s6 v. e) T9 B$ w2 J
i建议连接做对照，实验组加lignase，对照组不加酶，其他条件一致，不转化，跑胶看看问题出在哪里。
+ d6 u6 H, }( s9 J7 Z, w: v3 y如果是连接不成功，就是连接及之前的问题；若连接上就是感受态细胞太差。

c05241037

克隆的问题有很多可能性，想想问题所在，做做验证试验，不要只是换条件做重复。希望能帮上你一点。