脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。) ?  X- A3 j- D7 V. N6 O* F
到底什么原因呢？？？ 0 g1 H& C4 T& g0 o6 n/ z; Y& c
4 e  P3 l; J' Q3 g! x; v2 }
附上Ficoll说明书
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pailishi

这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11
% t: J0 s8 Z* @6 p$ ~9 Q这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

, O' U) r; x/ Q
哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

小猪快跑

你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离出来的四层分界还是很明显的，要提取的细胞量多的话白雾层是比较明显的，不像量少的时候那么模糊，但是条带不会太宽的

wangzhiqi86

1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
1 y4 V" ~8 t/ G1 w2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序" N. @9 ]/ D# m" w' M  v* w6 @
3.细胞悬液要逐滴加到Ficoll上面，一定要慢，不能混合
' Q1 w. m& q7 i' C- t4 @5 K4.确实要取白膜那一层，因为MSC就在里面，你轻轻摇晃50 mL离心管可以看到白色层在轻轻晃动
( w% [3 \6 }9 Q9 c6 P5.1.077g/L的比重分离MSC没问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56
7 H' [4 w$ {" V" S& E: u1 @6 l8 _: F1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
1 C4 c" c% Q8 i% I7 b' j2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序
' e0 w' ]% R- I/ p* X3.细胞悬 ...

0 t" w# Q6 [' p3 m) G2 B9 T1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm
9 O4 O: o6 ^2 z5 k2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度
' B$ s3 N. z+ X3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了
' V7 m" _) V( A5 ~- d4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？/ m4 b& t5 v3 @6 m; n* M8 t
5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC
! n# }1 G9 V1 }
) W- F: q6 A1 D5 b0 Y( I5 r请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？8 d" T. P# |& j
- G1 s$ [2 S* B
还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47   H' a2 I( ]: u, o: d# a
你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

* J, j& S& L% B0 u8 Z$ m是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。. [+ q% \% \- h. X5 I
他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？: N0 `) I0 _. |9 @' J. e. P
肿么办？白膜层不对劲啊！！！

Roden

目测有两个个问题* T, T, i$ @3 B! O4 G( ]* v
1.血液是否稀释，比例多少？. m0 ~. _' ]( C& X& d
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

ly200101042

我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min+ F1 K  @* t: m! H6 f) c
还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例，我们这一般是血液稀释一倍，稀释后淋巴细胞分离液与稀释血液的比为1:1或1:2。
: y3 u, W$ z+ p6 p肝素抗凝不会有影响的。

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23 + A4 ^2 r+ c% T9 T$ \& r  s
目测有两个个问题3 \) A$ N) o! S0 ?0 e5 r) g
1.血液是否稀释，比例多少？$ K! J, y0 H6 f
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

  C* d5 F  R( e  ~3 [( M1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的% K; \. {7 n5 x; G5 _2 [
2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。