脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。' m+ A7 O6 g# r" r+ d+ J0 c
到底什么原因呢？？？   s" N. R/ e. j4 [* a: _

4 ?3 O0 C( ?/ O3 j% a: _5 X, w附上Ficoll说明书! I0 j& D6 d* v/ [2 l3 `# j9 l9 g

pailishi

这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11
( |2 E8 ?# f! M$ u5 \# j6 x9 P这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

% X) E2 \1 m6 Z- y! |* ^- H: ~
哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

小猪快跑

你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离出来的四层分界还是很明显的，要提取的细胞量多的话白雾层是比较明显的，不像量少的时候那么模糊，但是条带不会太宽的

wangzhiqi86

1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
$ W/ z8 b* ?0 Z9 J& l/ O2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序' C1 h; j8 |9 M, H- O4 w
3.细胞悬液要逐滴加到Ficoll上面，一定要慢，不能混合
6 q# N! k+ [4 N7 Y' h# o% R4.确实要取白膜那一层，因为MSC就在里面，你轻轻摇晃50 mL离心管可以看到白色层在轻轻晃动2 p7 N/ `8 K5 M, U# M
5.1.077g/L的比重分离MSC没问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56
* Q  s; F* e" e" G* `1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
) P' R6 g  D% Z: y3 F" P9 O2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序
. ^) b6 Q" `6 q- M( F; {' M3.细胞悬 ...

, @; r2 U/ Z: J1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm
4 V' T5 }& }7 Z: U6 b8 g/ x+ o2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度5 q  S7 S8 b$ T# J$ w+ R  @
3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了5 d% E# A! E! ?# n8 F3 F$ a& Z5 r7 {
4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？8 Q/ J' E  C- p5 z: m
5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC
8 L: n8 V" T2 o1 P& v# ?8 r1 V9 X3 _2 W3 n
请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？2 t/ c7 N8 W! e& {* ~8 p: j  [

- J& _/ C4 |. v0 ?  `- H还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47 " N' j. G' j/ c' P" b+ _$ T8 Z+ _
你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

! r1 }9 ~: |) e& E
是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。
- m  b' U# W! `5 M" w+ f2 F他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？- r6 c2 Q# p; n9 N( t( F: U
肿么办？白膜层不对劲啊！！！

Roden

目测有两个个问题8 }5 r2 f% C0 H2 J2 K2 j
1.血液是否稀释，比例多少？
+ x0 Q  p( S  K* _2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

ly200101042

我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min: f* n: u0 x+ u
还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例，我们这一般是血液稀释一倍，稀释后淋巴细胞分离液与稀释血液的比为1:1或1:2。6 K- F' i: ]8 D
肝素抗凝不会有影响的。

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23 1 E- u& a' w: n4 b- V  R3 o
目测有两个个问题& ^5 D* Q; f5 I( |6 K/ m6 t
1.血液是否稀释，比例多少？1 c$ ]1 T2 }! F1 j  Q3 {" O/ ]
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

3 ]1 U3 T2 ~9 }0 ?1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的- n, H6 {: A* e$ x' H5 H9 H+ d
2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。