脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。4 U' D5 i# F* M$ Z) ?0 Q6 a) v
到底什么原因呢？？？
* d# B1 \; e5 r7 a0 e1 g0 Y1 o0 O" c) n# I
附上Ficoll说明书! W) Y: y. p9 v

pailishi

这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11
# H4 p1 s/ q& D2 \2 L, Z( @7 r3 P这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

) C: d( _# k7 T
哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

小猪快跑

你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离出来的四层分界还是很明显的，要提取的细胞量多的话白雾层是比较明显的，不像量少的时候那么模糊，但是条带不会太宽的

wangzhiqi86

1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
8 I3 o2 Z5 z( [2 h2 I1 ?: B2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序
; V. T. m+ _9 E% y/ @3.细胞悬液要逐滴加到Ficoll上面，一定要慢，不能混合1 Y/ ~5 A9 R# }  D7 q+ f
4.确实要取白膜那一层，因为MSC就在里面，你轻轻摇晃50 mL离心管可以看到白色层在轻轻晃动: g$ m# K% y2 \
5.1.077g/L的比重分离MSC没问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56 . Z3 r; x1 N# D% T, V
1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
: D! g& x: l$ x* {/ J2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序) y5 k- S* k* _
3.细胞悬 ...

/ S( i2 k* i, X+ W. n, @+ s1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm
7 X: i9 |$ V3 r5 Y( r0 @2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度
0 t+ r1 ^% V% Q1 ~+ E1 p3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了& Q, ?+ {* ]; i2 u( ]
4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？1 W- T; u, z. T4 r. u3 d# l# @
5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC
5 C  ^5 a  c6 ]# R& u& R8 l" D+ e
  T4 D) v: n0 h. i1 `* M请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？0 v* L: r" \) g' |7 b; ?
7 v+ g( s4 z. G  L. F2 p
还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47
* a) W9 z# R. }& y  ^" t8 m' Y你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

7 S& E; z2 P  R8 q是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。
% O& F+ o  v9 I# o4 h9 l他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？7 z9 b3 m. z, t# o- F! w
肿么办？白膜层不对劲啊！！！

Roden

目测有两个个问题
! d# \1 u# {6 ?9 f  I1.血液是否稀释，比例多少？) J: }/ Q! v1 g3 `
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

ly200101042

我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min
& F0 P, m7 A! Q还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例，我们这一般是血液稀释一倍，稀释后淋巴细胞分离液与稀释血液的比为1:1或1:2。1 I4 V5 c: f2 L# n4 R* g
肝素抗凝不会有影响的。

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23 6 A' {& E- j$ a; r! h  ~9 S: f4 I
目测有两个个问题
: }; J- q7 F; A' z1.血液是否稀释，比例多少？( ?  a, D2 J. `* r
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

/ k6 \# {0 x( O1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的
, \5 L9 o9 Z3 `  [3 ~  ]) {2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。