脐血MSC的分离！为何Ficoll的单核细胞层如此不清晰？（附图）

huajie881026

做了几次脐血的MSC的分离，每次用Ficoll分离时白膜层（MNC层）都不是很清晰，并且这层很宽。为什么呢？有没有谁也遇到过类似的问题？取白膜层的话有要取这么厚一层吗？困惑！！！我用的是GE的Ficoll  1.077的（借的别人的），用500g 、18℃离心30-40分钟，自己买的Ficoll  1.073的还没送到（看Ficoll的说明书上说1.073的适合分离MSC，因为MSC的密度更低）。( }7 S$ i( X+ i! ^+ O
到底什么原因呢？？？ : _9 B) ~+ ^4 M8 {, r9 s3 r

6 p2 J2 Y* ^& g" B附上Ficoll说明书. B* O( Q, l7 u% ?  r5 D  |

pailishi

这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

huajie881026

pailishi 发表于 2012-7-24 12:11 8 x% ]9 X$ e# I8 p
这个肯定不对，应该是很薄的一层，白色的

/ Z' [  K2 x) D1 A
哪里做错了吗？求指点！困恼啊。。。

小猪快跑

你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离出来的四层分界还是很明显的，要提取的细胞量多的话白雾层是比较明显的，不像量少的时候那么模糊，但是条带不会太宽的

wangzhiqi86

1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧. [4 H3 @/ M8 Q: l6 R
2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序
% K3 w0 P0 D, G1 Y4 r. r+ ~3 Z3.细胞悬液要逐滴加到Ficoll上面，一定要慢，不能混合
  X, R! J; O5 P+ l3 Z% @% c3 D4.确实要取白膜那一层，因为MSC就在里面，你轻轻摇晃50 mL离心管可以看到白色层在轻轻晃动# c+ _3 `6 m4 D2 M* U4 T4 s
5.1.077g/L的比重分离MSC没问题

huajie881026

wangzhiqi86 发表于 2012-7-24 13:56
: _0 N* Y  I5 J* @1.不知道你的500g是多少转，3000 rpm左右吧
* W2 y0 p* P; [- l2.离心开始和结束时都要用最慢加速度和减速度的程序' Q8 U/ l9 P  @  W& F0 g
3.细胞悬 ...

( n' M" f9 X  _  e5 O1、我这边的500g是1667rpm，400g是1491rpm
) e( O1 x1 W& ]0 `* [9 G2、离心开始和结束时都用了最慢加速度和减速度& a9 \2 L# o# t
3、细胞悬液是逐滴加到Ficoll上面的，每次三管50ml离心管加满都花我30分钟，已经很慢很小心了+ V& B* b& G( L8 \" o
4、我的确是看到了白膜层，但是上下界限不是很清晰，是怎么回事？) m; y- V# {5 s* e
5、1.077应该是没什么问题，我看文献和论坛里大家也都用的是这个，但是GE  Ficoll说明书上说1.073的更好，更适合分离MSC' R0 j! v2 I( x
+ N8 K3 e/ G0 ]- @# j+ V+ h
请教大侠：会跟肝素抗凝了有关系吗？因为临床的脐带血他们抽的时候都是2ml肝素钠（12500单位）抗凝这50ml血的，肝素钠是不是有点多了？; D+ l& b: n" \7 X' d4 @+ l
! _. }' q4 x; R$ P# _( K- }
还有做的时间有限制吗？我一般都是拿到脐血后6-8小时开始做，是不是应该拿到脐血尽快就做？

huajie881026

小猪快跑 发表于 2012-7-24 13:47 0 [" f; g/ J& t  I/ o6 P' g2 e
你是按说明书上操作的吗？他给你的分离液有没有过期啊，还有他用过之后是不是保存在四度冰箱里啊，正常分离 ...

. x1 s( h+ ]* s3 ^- c) N& w: T6 y是的，完全按说明书上操作，分离液没过期。
1 b. m. L. |6 R他都是室温下保存的（25℃），因为Ficoll上说4℃-30℃保存，并且要避光，放冰箱的话别人开啊关的会有灯光影响，所以都放室温保存，这会有影响吗？8 h4 [7 A# @8 \: y
肿么办？白膜层不对劲啊！！！

Roden

目测有两个个问题3 ?( C2 v8 N9 N- j% O
1.血液是否稀释，比例多少？1 _: U% j; d& l
2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

ly200101042

我觉得离心时间偏长了，我们这一般是20min
1 d& Q( l4 g: @0 U0 u还有得注意下血液的稀释比例和淋巴细胞分离液与稀释血液的比例，我们这一般是血液稀释一倍，稀释后淋巴细胞分离液与稀释血液的比为1:1或1:2。8 Y. M/ K8 L1 l% I! h( I
肝素抗凝不会有影响的。

huajie881026

Roden 发表于 2012-7-24 15:23 7 T$ Y3 ^: B9 y( i: ~( @
目测有两个个问题0 Z, h1 ?9 ]4 X9 n: D& W0 }
1.血液是否稀释，比例多少？
: l$ l9 u  f/ f6 T3 G* @2.淋巴细胞分离液与稀释后血液比例为多少？

1 i8 x  b1 v  U
1、血液与PBS1：1稀释的，50ml血与50mlPBS混匀的3 \2 @  y! ~: k$ e$ |5 Y
2、淋巴细胞分离液与稀释后的比例为1：2，即我每次拿50ml脐血，与50mlPBS稀释，最后用50mlFicoll来分离，所以这方面应该没有问题吧。