角膜缘干细胞移植技术及临床结果（四）LSCD treatmentのfuture

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陆续通过4个帖子，全面介绍角膜缘干细胞缺损临床治疗的手术方法和临床结果1 q$ @: o+ Z# y
这是第四篇(也是最后一篇) ，关于LSCD治疗未来仍需解决的问题$ L, {7 m* }( U% Q% v1 o% H3 z- J- a

: e: ^+ T& K; D; ^1.5.1 对临床用途的体外培养细胞的管理
+ q9 d2 U7 d% S+ h8 R( w随着细胞治疗的盛行，政府部门对实验室内移植物的生产过程也有了严格审查，相应的要求规定也水涨船高。那些为人类移植而进行的不正规的细胞培养工作也不再得到默许。欧盟区内提供细胞治疗的机构必须遵守欧盟的法律条文，只有由具有一定资质的细胞库才可以生产移植物，并且要严格遵循良好操作规范（good manufactory practice, GMP）。细胞库的设备和操作进程必须由相关机构来定期审查。在美国，对组织库的管理更加繁琐，虽然现在还没有关于细胞治疗的管理办法，但FDA已经出台了与GMP相似的新的细胞库的管理办法，加大了审查和检查力度。讽刺的是，严格遵守这些条文规定是否会影响本来难度就很大的细胞培养，进一步说，是否会影响手术的结果和成功率，这就不得而知了。
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6 N) K* `( b& s& |1.5.2 证实体外培养组织中有干细胞存在
/ b1 M  h' J. O- T' G# m证实体外培养的移植物中是否有干细胞存在，依据三个标准：1.集落形成能力测试（只有干细胞能形成大的细胞团，成为holocone），2.免疫组化寻找干细胞特异表达蛋白，3.供体细胞的存活情况。Schwab et al.评估在组织工程移植物中有2%-9%的细胞与干细胞有相似的集落形成能力，在他构建的复层细胞中，基底层细胞表达角蛋白19、β1整联蛋白以及p63，显示这些细胞与角膜上皮细胞相比分化程度较低，具有角膜缘干细胞类似的特征，但仍不足以证明这些细胞就是角膜缘干细胞（至今仍没有发现角膜缘干细胞的标志蛋白）。正常情况下，角膜缘干细胞的比率可能要低于9%，它在整个角膜缘上皮中只占非常小的一部分。: A6 P/ A/ e& a! i/ R

4 v2 f8 ~& D) U7 ?1.5.3 角膜缘干细胞手术治疗效果评估
8 |( u1 d; @9 l: b4 c不同研究组对角膜缘干细胞诊断与体外培养角膜干移植手术是否成功而设定的标准相差很大。Rama et al.基于裂隙灯显微镜下观察和细胞印记学检测结果建立了一套评价体系，在术前和术后不同阶段分别对眼表客观地评估，并进行统计学分析；Koizumi et al.和 Daya et al.也通过对一些临床参数的统计来确定手术是否成功；另有一些文章，虽然声称术后眼表症状有所改善，但是都没有进行术前和术后的对比，而且没有给出明确的参数和评估标准。有的小组开始用细胞印记学检查和相差显微镜观察结果来确定角膜表面是否有角膜上皮样细胞存在，这个方法可以客观地、半定量地确定术后角膜表面的细胞成分。
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1.5.4 一些仍需要解决的问题7 O. ^) o' b+ v2 ?, H
角膜缘干细胞的体外扩增培养和移植已经在多个国家进行了临床试验，并且可以治疗一系列与角膜缘干细胞缺损相关的眼表疾病。虽然相关的数据在不断增长，但是对这一技术的理解仍然不透彻，有很多关键问题需要解决，比如移植上的角膜缘干细胞是如何在眼表工作的？通常认为治疗术的成功关键在于外来的细胞是否能够与角膜表面牢固地结合并且发挥角膜上皮细胞的正常功能，但是仍有人认为是移植物，包括羊膜和外源细胞，在帮助并刺激病人自身的干细胞通过快速扩增来修复眼表，但这一猜想无法解释完全角膜缘干细胞缺损治疗的成功。于是有人猜想，是位于巩膜基质中的骨髓来源的干细胞进入角膜并分化，发挥角膜上皮细胞的功能，事实证明，当进行了骨髓干细胞移植，干细胞缺失的眼表确实得到了一定程度的改善，并且这些细胞能够表达角膜上皮细胞特征性蛋白K12.% ?- q# k- t0 v# W
另一个有趣的现象是，文献报道的体外扩增培养角膜缘干细胞移植的手术成功率都惊人的相似，于是我们是否可以推测，只要能成功地把活的角膜缘干细胞移植到眼表就行了，具体什么方法并不重要；另一方面，由于没有人能够观察到移植上的细胞能够在眼表撑过9个月时间，但9个月之后眼表依然保持健康，所以没有必要非要保证移植细胞的长期存在，人体可能拥有其他不明的机制来修复眼表的细胞表型。/ v6 o- ^- h7 ~7 l4 m6 s5 F
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结语：$ p7 ~) u8 g% A3 ?  o/ x; x
对于角膜缘干细胞缺损的治疗是非常复杂的，细胞治疗的方法很大程度上提高了手术成功率，规避了许多手术风险，但是这项技术仍处于起步阶段，其中有很多细节问题等待科学的解答。