MEF用丝裂霉素C处理第二天就崩盘

刘森泉

MEF用丝裂霉素C处理第二天就崩盘，用的是海正药业的临床注射用丝裂霉素C，加的浓度是10ug/ml 一小时或7ug/ml 3小时。有没有人遇到过这种情况，望解析。

dwy

我用PBS和DMSO溶解的，暂时没有问题。

开心果王

我一直用的是海正的，没有发现细胞全死掉了的现象，我们一般处理后就消化计数并冻存起来了，并没有继续培养，只是在复苏后会发现有死细胞漂浮，但贴壁的细胞还不错啊！我是用PBS配的，不知道楼主是否某个环节出现了失误还是什么其他的原因，可以将自己觉得疑惑的地方跟大家分享一下。

bibottll

我才做过的，细胞长得很好啊，5微克/微升，PBS溶解，处理三个小时后用PBS冲洗5-6次

wbj1983

上面的丝裂霉素C是：sigma-M0503-2mg的  h2 u" x+ A+ L) e+ I; D+ P
打字的时候打错了，非常抱歉！

wbj1983

回复 刘森泉 的帖子: @0 Z9 q. x& t) f: T) s1 Z* c" U
( W' J- C$ L) t- o
1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。
7 S8 W0 `/ g7 E2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。: k' ^1 z& m/ {+ Q1 ?3 V1 f3 X
3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。' |' x3 c9 p2 h
4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！- h: d- ^' G& t
5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。+ S3 z/ O7 ]% a, c' u- b
这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

wbj1983

1、MEF传代次数一般P3-5，不适合用代数太高的。
& K4 p; c- Q1 e8 `* y2 `. {2、丝裂霉素C最好用sigma-M0403-2mg的。
+ Q" m" f1 y3 M4 g& @" U3、2mg丝裂霉素C先用PBS溶解均匀，一般避光混匀5-10min，再加到培养液中，工作浓度10ug/ml。9 I' R  b1 X9 ^4 x) F' @0 p
4、处理时间2-2.5小时不能超过3小时。注，处理2-2.5小时后用PBS洗2次，此步骤很重要！
8 H; o2 U; _# C3 D5、冻存时如果经费充裕的话可以用10%DMSO+90%FBS，效果能佳。, s( R7 I& ?$ N) Z- Q3 _6 t: N
这是自己做Feeder的经验，大家可以参考，如有问题可以继续交流。

刘森泉

回复 huangcong1988 的帖子1 w0 F  m: e' Z& R

( E8 O- A2 `( o" f9 P5 C用同样的方法冻存下293T这些较好养的细胞，证明冻存方法OK的情况下只能看你的细胞状态了。

huangcong1988

回复 刘森泉 的帖子6 m% l* A/ \' A$ a9 H4 a  z
# H; s' f# R, ~$ W4 t
还有就是我分了MEF之后冻存，结果怎么复苏也复苏不起来怎么回事呢？程序冻存盒，冻存液也很好

刘森泉

回复 huangcong1988 的帖子  w) m) [# ?* J$ U9 S
8 ?- U. b8 q. n; P5 b
污染得原因多种多样，不能确定，能做的就是把PBS，胰酶，培养基全部换掉，重新复苏细胞试试。