PBMC提取已经摸索好了，准备摸索CIK，麻烦懂的人进来看一下，万分感谢。。。。。.。。

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前段时间一直在摸索PBMC，基本上已经摸索好了，现在准备开始做CIK了，但仍有几个问题不明，请知道的朋友解答一下，万分感激，呵呵！
5 z& i3 ~. {* P5 k$ K5 z+ a3 G1.PBMC提取完之后，我准备放到直径为100mm的细胞培养皿中培养，问题是PBMC的量是多少，我在文献中看到的是1x10 6/ml，那一开始加10ML培养基的话，那就要1x10 7的细胞，是否比较多了？？？- s7 n4 U/ L, Q% o$ I. d7 Z% g
2.培养CIK一般利用什么培养工具培养？如果我一开始用直径为100mm的细胞培养皿，养到多少天后换成培养瓶（还是培养袋？），用什么规格的培养瓶或者培养袋？？？换液和传代的时候是否要离心？' b$ A* m: A* [# L/ c
3.我采用的方法是于当天加入rh IFN-r 1000U/ml（请问是提取完PBMC立马加入，还是PBMC培养了2H吸取上清后加入），放置5%CO2、37oC孵箱中培养24h后，加入CD3 mAb 50ng/ml、及rhIL-2 1000U/ml继续培养，每3d换液并补充rh IL-2，培养至第14、15天，终细胞数为2x10 9-3x10 9。不知道这种方法是否可行，还是现在还有什么更好的方法，望赐教。
) z- a1 C/ y8 Y' C. w4.CIK培养完成后，一般是用什么方法检测，看的比较多的是流式细胞检测CD3，CD4，CD8，CD56，这种检测方法是否能够说明问题？？？
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问题比较多，问的也比较乱，望大神能针对我的问题解答一下，谢谢！我的QQ是113305060。

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回复 花饶然 的帖子
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非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊
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5 s, H6 L$ o( y4 A9 e还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧

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回复 meixue1130 的帖子1 L5 y2 x3 x9 t! N* B# z3 W2 F
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非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊' u7 s! r3 z. r- F8 h- I' G

' w$ [; R( g% P+ K: g' d还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧

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再追加一个问题，就是如果从第一天（提出PBMC后加RH IFN-r）开始算，大概多少天能够诱导为CIK（能够通过流式检测出CIK）？？？？？？是不是随着培养时间的深入，CIK会越来越多，CIK本身会增殖吗？还是什么情况？？？？？？一般需要多少天能将原来1*10 7细胞量的PBMC诱导为终细胞数为2x10 9-3x10 9 CIK？？？？？？谢谢！

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回复 woosheng 的帖子4 v! B* V" h9 K$ `$ F! S
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我在网上查到的细胞培养用的CD3 mAb 是PROSPEC的，具体说明是http://www.prospecbio.com/CD3_Human_Antibody_12_99/: S! i! T2 ^4 o% H6 C* n
不知道能不能用？你们用的CD3 mAb是什么品牌和规格的，能告知吗？谢谢

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回复 莫邪小仙 的帖子
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$ M7 c: G# h' \: J; @& @谢谢您的回复

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回复 liutianhua 的帖子3 T! v4 q4 X' @0 y& O5 P. k
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打算用1640培养基+10%FBS+0.5%双抗。打算先做研究，后做临床。临床是不是要用到无血清培养基，什么无血清培养基比较好？谢谢

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回复 liutianhua 的帖子
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我们采用的方法是采用淋巴细胞分离液分离抗凝全血，取白膜层，也就是提取PBMC。您提到的全血离心血浆，不知道是什么方法，能否详述一下，谢谢

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回复 liutianhua 的帖子4 x/ T% G4 {# ~: a9 l' v
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我也看过类似文献，但他们是先离心一次，把血浆和红细胞层间的白色层吸出来，然后再稀释密度离心。请问你们把血浆层也吸出来是什么原理，血浆层不是没有细胞吗，谢谢

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回复 liutianhua 的帖子
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- b3 N) R6 O9 ?" {) a谢谢您的答复，我再想问一下你们血拿回来之后先离心一遍，将血浆和血细胞离心，然后再将血细胞稀释淋巴液再离心，再离心前血细胞是取血浆和红细胞中间的白细胞层，还是取除了血浆外的所有细胞层（包括红细胞）？谢谢