求助免疫荧光大神

托斯卡纳教父

) o  O, }9 ?$ A+ j- [* h) @4 f( `! y

' B7 m& R7 M/ F" e# {& D小弟做了小鼠大脑冰冻切片，然后染了色，目标蛋白位于溶酶体上，但本应有荧光的样品却没有。% \9 ~% r- Y2 G: u# f3 Y; e: J9 K+ j
一抗：polyclonal sheep anti mouse IDUA% B+ ]5 [- p) ^" E# W7 ?! n7 S
二抗：donkey-anti-sheep IgG (1:500)3 n  r$ [! X# f1 q. e4 {
block: 5% donkey serum+0.3% Triton& `( l1 n" g/ l& N* z( `" z% H; G' r2 B
% W$ g& \4 C) T  \% R
我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100，效果都不是很好
, K4 ?  t1 T6 y+ t! O
* b- i" d( u! Z' n: Z$ j求问 我该怎么办6 {+ o: ^/ p8 o% |: ~) k
& Y, |1 q) f8 b7 i

托斯卡纳教父

我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理
9 u0 w$ m. h8 w% P. m新手上路 求各位提供宝贵意见

托斯卡纳教父

4 g) G! o/ G1 n
! D7 O3 o8 I/ C7 ^
回复 wiling123 的帖子  C1 F# x8 n# L, @$ f

$ Q9 R+ Y/ U9 n一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标，另一种抗体染了效果很好，应该不是固定的问题吧- r. Y) ~: V! v# ~3 h+ ?

& O2 A3 r( G8 C5 \: Q1L的图是提高浓度到1:100的; R0 z8 O$ U9 x( a5 @5 N. |% o
1:500的图在这里：

托斯卡纳教父

evial 发表于 2012-8-19 10:42
) R* q  o5 [8 a! q) F6 J8 ~真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多 ...

* ]8 i# \3 F  s0 {7 A是free floating sections with a freezing microtome.
, A9 M, S3 U. P8 M取材后4%paraformaldehyde过夜，30%sucrose 大概48h.
8 |8 d% l/ f3 W! L1 Z, o& J
" }! S7 z4 D' W# B  q0 G/ P, g8 {我是做的荧光双标，另一个一抗染色效果不错。

托斯卡纳教父

回复 小猪快跑 的帖子) i& Y+ e# _& u/ X

: }& H/ ~6 R$ @- C7 w, ~7 j2 }二抗1:5006 {0 v0 M1 ~4 l% i& ~
我觉得拍的速度够快了

托斯卡纳教父

回复 jhu132llh 的帖子- ^5 }+ J- {( I1 d3 [- ^# \; I
8 s; v: _. i+ E" @8 b
另一个抗体是NeuN， 染细胞核的，效果很好3 f* h8 t) A: V
一抗是才买的，应该还好。
6 m: o1 H& X6 a2 u8 A" T* u% {
0 a1 {) W" E. o2 U3 `: T8 r& N通透剂是指triton吗？我是在blocking solution里面加的0.3% triton x-100，抗体用blocking solution稀释的。  ~' S  n) z& @2 A: X0 Q
谢谢您的指点

托斯卡纳教父

回复 evial 的帖子
- l  ^3 h$ \' k; R& e7 y" l
- v+ Q0 c0 Q( c! }可能我和你所说的冰冻切片不一样
5 [2 E  h! D0 H* R. B5 T0 K0 n这是我去另外一个实验室学的
6 Y" h- V4 X( h5 F8 f0 @0 a* r& H. \
样品处理后，用干冰速冻固定在切片机上，切下来之后直接泡在特制的anti-freezer里，然后再染色。
8 c* U) U6 [& ^* y/ z- _1 F
, S% |; N; l$ Z9 j  |1 o我刚开始学的时候也很奇怪，因为我以前也做过冰冻切片，处理方法完全不一样。; P# q# r) }6 i' p5 L8 R0 o9 i! Q
谢谢你的回复