求助免疫荧光大神

托斯卡纳教父

8 l$ ^3 Y5 g2 W" H0 U- `# B$ I( j) P& a1 v- L: Z
小弟做了小鼠大脑冰冻切片，然后染了色，目标蛋白位于溶酶体上，但本应有荧光的样品却没有。5 U3 @( K1 s* n
一抗：polyclonal sheep anti mouse IDUA
% o8 Z) Q. `7 f5 ]; I# k二抗：donkey-anti-sheep IgG (1:500)" o& m1 o& c! j1 X' D9 Z
block: 5% donkey serum+0.3% Triton
$ _$ n7 o" J% C" p, O  B  @
7 f# ]* S, @6 x  v6 p我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100，效果都不是很好
0 h9 t% Z( [) P2 h5 {0 R# k+ _$ n( ?' q7 T1 v4 M4 m2 b
求问 我该怎么办
* N+ T- o8 ?4 E  _% n( K
  X) k. r' _7 f* u

托斯卡纳教父

我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理 # n/ E; @5 G5 C8 B* o% ]: X
新手上路 求各位提供宝贵意见

托斯卡纳教父

/ O, }+ p6 _; G; V
9 L2 t9 a* M! z( m) `回复 wiling123 的帖子. W% I5 {, q3 g- ]* z

/ `0 _4 n4 ]5 d) J# T一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标，另一种抗体染了效果很好，应该不是固定的问题吧; w9 |$ d. x; q% Y) F$ T1 ?! \
+ U. N9 @$ I; k8 p) A- U
1L的图是提高浓度到1:100的& s# h) J8 {; X) {: T& W
1:500的图在这里：

托斯卡纳教父

evial 发表于 2012-8-19 10:42
' g% |" @! F! U# v. \, m, O, h真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多 ...

$ Z' c' n1 T: D- o! b6 V% H. d0 M是free floating sections with a freezing microtome.% h' q! I! i2 X5 i1 S8 [! x& t2 `7 u
取材后4%paraformaldehyde过夜，30%sucrose 大概48h.. M7 }  U  p) V8 E" H5 B

. H' q) Q) d; t& t  }/ k我是做的荧光双标，另一个一抗染色效果不错。

托斯卡纳教父

回复 小猪快跑 的帖子
, r) a0 C* l% \) s/ h% K' z7 j9 k# i  q+ t! b
二抗1:500: \9 K5 c. F* A( K$ [% d9 p$ }; r
我觉得拍的速度够快了

托斯卡纳教父

回复 jhu132llh 的帖子! N' \! u* T' \( K
6 k* f2 z: p/ T: u! {
另一个抗体是NeuN， 染细胞核的，效果很好
+ u: p! d8 d: p" P- [一抗是才买的，应该还好。. n; U' ]- C6 m

5 q! V# }! C& ?% O通透剂是指triton吗？我是在blocking solution里面加的0.3% triton x-100，抗体用blocking solution稀释的。
0 H7 V( m. @- `- v! Q# v; E6 A3 I谢谢您的指点

托斯卡纳教父

回复 evial 的帖子3 I% B6 E% _; }; E; t

, }  C/ X6 o; c0 ~可能我和你所说的冰冻切片不一样
, n) _6 ^  E3 ?8 M; x' O这是我去另外一个实验室学的' E9 d* J" G8 m# F& k, B& h

  A1 k( E0 H) K3 m% X样品处理后，用干冰速冻固定在切片机上，切下来之后直接泡在特制的anti-freezer里，然后再染色。
* w, z$ T6 S8 j0 `2 t5 i' h6 e
* C* G& F, C, P* V3 X我刚开始学的时候也很奇怪，因为我以前也做过冰冻切片，处理方法完全不一样。
! P' M; W  L0 Q4 t1 ?谢谢你的回复