干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

 

 

搜索
朗日生物

免疫细胞治疗专区

欢迎关注干细胞微信公众号

  
查看: 69125|回复: 21
go

[请教] 求助免疫荧光大神   [复制链接]

Rank: 3Rank: 3

积分
559 
威望
559  
包包
1201  

优秀会员 金话筒

楼主
发表于 2012-8-18 23:11 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 托斯卡纳教父 于 2012-8-18 23:15 编辑
$ e7 z7 U' v7 C6 ~" L* T1 _; R' @1 X$ G# o# I( c8 W
小弟做了小鼠大脑冰冻切片,然后染了色,目标蛋白位于溶酶体上,但本应有荧光的样品却没有。
% y" L) ?& b% E. j& k8 U! v/ r一抗:polyclonal sheep anti mouse IDUA) x7 a' }5 a0 _
二抗:donkey-anti-sheep IgG (1:500)
- D# F1 V' x, S: c1 c3 Yblock: 5% donkey serum+0.3% Triton& ?, b$ ~$ w9 E. ~- h
6 X  k6 S) {0 e, W% J& d: i( n
我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100,效果都不是很好4 M% s% T, K: f7 ]2 I0 [
* o1 I1 L  k* C& B6 |- u
求问 我该怎么办, m* N4 N. @1 y: h! w% D; g
7 A, e' ]# d* e) k/ r1 x! e3 ]& O

图片3.jpg (15.71 KB, 下载次数: 225)

我的图片

我的图片

未命名.jpg (17.12 KB, 下载次数: 300)

别人文章中的图片

别人文章中的图片

已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
559 
威望
559  
包包
1201  

优秀会员 金话筒

沙发
发表于 2012-8-18 23:16 |只看该作者
我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理
7 R  m- H, i9 j4 D! N新手上路 求各位提供宝贵意见

Rank: 1

积分
12 
威望
12  
包包
74  
藤椅
发表于 2012-8-19 00:06 |只看该作者
一抗是哪个公司的?提高抗体浓度一点都没有改善吗?更高一点可以试试。, b( l0 m1 A* r1 I
0 `6 _% H* [! V9 |, v. m3 b3 C
我个人觉得,固定很重要,不知道你是用冰甲醛还是多聚甲醛。换一种固定看看。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
559 
威望
559  
包包
1201  

优秀会员 金话筒

板凳
发表于 2012-8-19 00:52 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
本帖最后由 托斯卡纳教父 于 2012-8-19 00:54 编辑
8 i2 h8 E' Z1 `* f6 z2 A, ?0 ~/ x# |
回复 wiling123 的帖子& ^# O0 O$ b& O5 b3 h! Z- Y

6 N. z) y+ W! q- }: l$ i% y" E一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标,另一种抗体染了效果很好,应该不是固定的问题吧/ c. W, c' V, Z+ q" j
7 d, {+ N% ~' g; G6 Z
1L的图是提高浓度到1:100的; k) h8 C: ?% h: `2 r" f
1:500的图在这里:

Het 20x IDUA_2.jpg (460.21 KB, 下载次数: 239)

Het 20x IDUA_2.jpg

已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
396 
威望
396  
包包
1235  

优秀会员 金话筒

报纸
发表于 2012-8-19 09:59 |只看该作者
1.封闭液中加入0.5%的tritonx-100,试一试!
+ o& K* X$ I% [* G0 ?3 K" \, x1 i) F. Y
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 3 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 3  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
142 
威望
142  
包包
548  
地板
发表于 2012-8-19 10:23 |只看该作者
二抗的浓度呢?还有拍照要快,有的荧光消失的很快的!
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 4

积分
1334 
威望
1334  
包包
4744  

金话筒 优秀会员

7
发表于 2012-8-19 10:42 |只看该作者
真是瞎折腾,你不是说冰冻切片么!怎么用甲醛多聚甲醛?那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的?时间花了多少?
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 3 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 3  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
559 
威望
559  
包包
1201  

优秀会员 金话筒

8
发表于 2012-8-19 11:31 |只看该作者
evial 发表于 2012-8-19 10:42
. W0 D. x+ n1 O' j真是瞎折腾,你不是说冰冻切片么!怎么用甲醛多聚甲醛?那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的?时间花了多 ...
2 ~* I# O5 N! o( j! N
是free floating sections with a freezing microtome.
3 Q2 D/ C  M, u. ~2 _+ H5 S4 O取材后4%paraformaldehyde过夜,30%sucrose 大概48h.
& m& G$ b$ F, X, o
! T+ t  g% `, j我是做的荧光双标,另一个一抗染色效果不错。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
559 
威望
559  
包包
1201  

优秀会员 金话筒

9
发表于 2012-8-19 11:32 |只看该作者
回复 小猪快跑 的帖子
! b& \( V& ?; `: a& C& ?
' B1 n4 V* K3 t8 J1 B二抗1:500) M, C# S0 o* W- t! D
我觉得拍的速度够快了
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 1 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 1  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
955 
威望
955  
包包
755  

热心会员 优秀会员 小小研究员 积极份子 帅哥研究员 美女研究员 金话筒 精华勋章

10
发表于 2012-8-19 19:44 |只看该作者
我的感觉只要一抗好,做起来就比较容易。, P( V2 L! C1 `" }& J" E; f
你做冰冻切片的话样品不要先固定再切片,应该先冰冻再切片,然后短暂固定一会。这样的话对抗原的损伤小。% \. N0 Y3 x2 B$ E
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

‹ 上一主题|下一主题
你需要登录后才可以回帖 登录 | 注册
验证问答 换一个

Archiver|干细胞之家 ( 吉ICP备2021004615号-3 )

GMT+8, 2025-6-11 05:21

Powered by Discuz! X1.5

© 2001-2010 Comsenz Inc.