求助免疫荧光大神

托斯卡纳教父

$ e7 z7 U' v7 C6 ~" L* T1 _; R' @1 X$ G# o# I( c8 W
小弟做了小鼠大脑冰冻切片，然后染了色，目标蛋白位于溶酶体上，但本应有荧光的样品却没有。
% y" L) ?& b% E. j& k8 U! v/ r一抗：polyclonal sheep anti mouse IDUA) x7 a' }5 a0 _
二抗：donkey-anti-sheep IgG (1:500)
- D# F1 V' x, S: c1 c3 Yblock: 5% donkey serum+0.3% Triton& ?, b$ ~$ w9 E. ~- h
6 X  k6 S) {0 e, W% J& d: i( n
我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100，效果都不是很好4 M% s% T, K: f7 ]2 I0 [
* o1 I1 L  k* C& B6 |- u
求问 我该怎么办, m* N4 N. @1 y: h! w% D; g
7 A, e' ]# d* e) k/ r1 x! e3 ]& O

托斯卡纳教父

我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理
7 R  m- H, i9 j4 D! N新手上路 求各位提供宝贵意见

wiling123

一抗是哪个公司的？提高抗体浓度一点都没有改善吗？更高一点可以试试。, b( l0 m1 A* r1 I
0 `6 _% H* [! V9 |, v. m3 b3 C
我个人觉得，固定很重要，不知道你是用冰甲醛还是多聚甲醛。换一种固定看看。

托斯卡纳教父

8 i2 h8 E' Z1 `* f6 z2 A, ?0 ~/ x# |
回复 wiling123 的帖子& ^# O0 O$ b& O5 b3 h! Z- Y

6 N. z) y+ W! q- }: l$ i% y" E一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标，另一种抗体染了效果很好，应该不是固定的问题吧/ c. W, c' V, Z+ q" j
7 d, {+ N% ~' g; G6 Z
1L的图是提高浓度到1:100的; k) h8 C: ?% h: `2 r" f
1:500的图在这里：

wang3033

1.封闭液中加入0.5%的tritonx-100,试一试！
+ o& K* X$ I% [* G0 ?3 K" \, x1 i) F. Y

小猪快跑

二抗的浓度呢？还有拍照要快，有的荧光消失的很快的！

evial

真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多少？

托斯卡纳教父

evial 发表于 2012-8-19 10:42
. W0 D. x+ n1 O' j真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多 ...

2 ~* I# O5 N! o( j! N
是free floating sections with a freezing microtome.
3 Q2 D/ C  M, u. ~2 _+ H5 S4 O取材后4%paraformaldehyde过夜，30%sucrose 大概48h.
& m& G$ b$ F, X, o
! T+ t  g% `, j我是做的荧光双标，另一个一抗染色效果不错。

托斯卡纳教父

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! b& \( V& ?; `: a& C& ?
' B1 n4 V* K3 t8 J1 B二抗1:500) M, C# S0 o* W- t! D
我觉得拍的速度够快了

runsong

我的感觉只要一抗好，做起来就比较容易。, P( V2 L! C1 `" }& J" E; f
你做冰冻切片的话样品不要先固定再切片，应该先冰冻再切片，然后短暂固定一会。这样的话对抗原的损伤小。% \. N0 Y3 x2 B$ E