求助免疫荧光大神

托斯卡纳教父

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3 Z: [% g( z9 |; s+ x/ j9 j' u
小弟做了小鼠大脑冰冻切片，然后染了色，目标蛋白位于溶酶体上，但本应有荧光的样品却没有。1 b8 ?8 b2 f" \
一抗：polyclonal sheep anti mouse IDUA0 h; d$ V" J2 G$ K& B
二抗：donkey-anti-sheep IgG (1:500)
. a- F1 s9 A- i# v5 Pblock: 5% donkey serum+0.3% Triton! ]. _2 t+ R) a: K  [0 d4 }

( O6 X. z: E! `6 V我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100，效果都不是很好- G: T: l0 o- ?, D/ O6 q" O+ r1 C
8 Y5 L4 T7 f% @1 E( i0 g+ @
求问 我该怎么办
& F" W' o3 K! P' C2 e+ m) S% n6 x3 y! x* a0 h, k

托斯卡纳教父

我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理
% n+ o+ H$ Y; r  j0 W" r/ R新手上路 求各位提供宝贵意见

wiling123

一抗是哪个公司的？提高抗体浓度一点都没有改善吗？更高一点可以试试。
: U# a& B; x% z1 w+ t" L
) P8 j5 U5 Z  G+ @我个人觉得，固定很重要，不知道你是用冰甲醛还是多聚甲醛。换一种固定看看。

托斯卡纳教父

) s3 H: d' t$ r7 A/ U: f# B; }# E
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6 }7 ]) U+ A' t9 _( q5 @. [一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标，另一种抗体染了效果很好，应该不是固定的问题吧# m9 }2 v6 {% L* j+ H- X, f

+ u; A; w2 c/ L& k3 h1L的图是提高浓度到1:100的1 `* k+ e2 Z- `1 c+ I6 h) }7 b& P7 t
1:500的图在这里：

wang3033

1.封闭液中加入0.5%的tritonx-100,试一试！8 ?- Y3 e- [4 ^' k; R! p

小猪快跑

二抗的浓度呢？还有拍照要快，有的荧光消失的很快的！

evial

真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多少？

托斯卡纳教父

evial 发表于 2012-8-19 10:42
3 [7 X- l" d( Q真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多 ...

, Y9 ^/ ]9 Y, h( T# W/ i8 x1 V' }( x( Y是free floating sections with a freezing microtome.
4 d9 X7 u/ w/ o6 O取材后4%paraformaldehyde过夜，30%sucrose 大概48h.
0 p7 S$ Z" C0 O6 |% V; h- J# T. l( J
我是做的荧光双标，另一个一抗染色效果不错。

托斯卡纳教父

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二抗1:5003 v& u! X5 r2 ]8 `& G# }2 E0 H
我觉得拍的速度够快了

runsong

我的感觉只要一抗好，做起来就比较容易。% U9 P4 v0 Q0 N: o/ p
你做冰冻切片的话样品不要先固定再切片，应该先冰冻再切片，然后短暂固定一会。这样的话对抗原的损伤小。
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