求助免疫荧光大神

托斯卡纳教父

% k( i/ V' u5 l
" `5 N% |2 d/ S. y
小弟做了小鼠大脑冰冻切片，然后染了色，目标蛋白位于溶酶体上，但本应有荧光的样品却没有。
- R: m! f3 H0 D. {一抗：polyclonal sheep anti mouse IDUA+ G  k  _: |5 v  [9 ^  Q
二抗：donkey-anti-sheep IgG (1:500)
2 C! E( V  W8 J0 qblock: 5% donkey serum+0.3% Triton
8 @- `0 v* x& X" f5 ?& I# u2 p6 F+ Y
我尝试了不同一抗浓度从1:500 到1:100，效果都不是很好. N$ U* b, F: k" m

  q. \. N4 e2 u* G/ }# z/ m, z1 m" a求问 我该怎么办: F5 ^; x6 j. E
" k: w2 I( ]* o7 t$ p

托斯卡纳教父

我用的显微镜的确不太好 也没用PS后期处理 ! N) I6 K6 Z, S& x
新手上路 求各位提供宝贵意见

wiling123

一抗是哪个公司的？提高抗体浓度一点都没有改善吗？更高一点可以试试。! z( [! ^) k: U) x4 a/ V/ a  g( @
2 H1 B" C1 N: t$ C' j
我个人觉得，固定很重要，不知道你是用冰甲醛还是多聚甲醛。换一种固定看看。

托斯卡纳教父

0 y" h$ `" W5 q+ d1 G, T0 B8 }9 R
回复 wiling123 的帖子3 O* }0 g$ J! \3 |' z

$ U& S6 y) O3 }7 B( C一抗是R&D   用的多聚甲醛  我是做的荧光双标，另一种抗体染了效果很好，应该不是固定的问题吧: G" X$ p0 o1 r
0 [: s6 Q+ }4 f9 z* Y2 B
1L的图是提高浓度到1:100的
: q7 V; M) t; R  @" i$ U1:500的图在这里：

wang3033

1.封闭液中加入0.5%的tritonx-100,试一试！
5 e2 U7 [* }5 [) O/ F5 V, U

小猪快跑

二抗的浓度呢？还有拍照要快，有的荧光消失的很快的！

evial

真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多少？

托斯卡纳教父

evial 发表于 2012-8-19 10:42 6 `  x  E9 q. E1 V# K: L
真是瞎折腾，你不是说冰冻切片么！怎么用甲醛多聚甲醛？那是做石蜡用的。取材后你是怎么处理的？时间花了多 ...

3 g* U6 G- R% c* t* `) P
是free floating sections with a freezing microtome.. n; D2 d7 Z0 \
取材后4%paraformaldehyde过夜，30%sucrose 大概48h.
- x3 j, [3 p7 V
) i% h, K. ]8 C! Z我是做的荧光双标，另一个一抗染色效果不错。

托斯卡纳教父

回复 小猪快跑 的帖子& a+ |. M) U" F  X' m( Z1 Y1 Q7 N

% G6 P) c) p2 K' S0 P/ V二抗1:500
8 u9 j3 [- T7 ~3 t/ M" @* e我觉得拍的速度够快了

runsong

我的感觉只要一抗好，做起来就比较容易。
0 d; T, J: D: B- P% S  D9 n* i5 T0 u你做冰冻切片的话样品不要先固定再切片，应该先冰冻再切片，然后短暂固定一会。这样的话对抗原的损伤小。' F' E0 t7 a/ j0 J2 J7 _8 X) R' F4 z