小弟向版主及各位PCR高手求助，帮忙解答，谢谢~

Dongqin11

首先，你这个primer设计也太简单了吧，现在市面上不是有很多引物合成软件吗？比如那个vector，primier,oligo等等。而且对于你设计出来的引物有很多要求，比如其GC含量以40-60%为宜，引物对应模版序列的Tm为72最好，选择引物二聚体及发夹结构能值最低的。引物3’端一定要与模版完全配对，不能出现3个连续碱基，末端避免使用A。" u+ L+ E' l7 r+ e5 i  r
还有，我不知道你的目的区域有多大，当你的目的区域小于200bp时扩序要加大，引物尽量向两边移，要挑两边特异性最好，Tm最适合的。
5 v# J+ d* A- \8 n4 A最后，一般PCR时在条带最下面可能会有两条杂带，一个是引物二聚体，还有就是dNTP。如果你还有其它杂带，那只能说明你的引物特异性差，p出其它部位的片段。

Dongqin11

回复 caifranklin 的帖子# n. f& e  L6 n
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你可以试试两步法PCR，不用设退火温度。其它都一样。