有谁从睾丸组织中分离过初级精母细胞吗？

随心

想从睾丸组织中分离出粗线期精母细胞，有谁知道具体步骤吗，睾丸必须是新鲜的吗？可以冷冻吗？可以的话在多少度冷冻？？？谢啦

490096812

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/ c: b  R1 q! s8 @+ k% I对啊，冻存的话很多东西就改变了，细胞状态也不好，所以还是建议你采来了不要冻存，我们冻存是为了验证冻存后还能用，实际很少用的。你在低温下12小时是没有问题的

ying

其实我觉得你要是能找个助手就好了。助手帮你取，你来计时并且做spread。反正曲精小管要泡在低渗液里面半小时的。

ying

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你要是取了之后第二天做的话，我建议你先做一下预实验：1 _7 V: y( ^, S3 Y5 Q
将曲精小管大约1厘米（很少）泡在500ul DMEM-FBS-PS里，放在4度。然后你第二天来做spread。我估计是可以的，不会死太多。但不知会不会细胞状态变差使得实验结果不真实。
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我曾经将消化成单细胞的睾丸mix细胞放4度过夜，第二天用PI染色，发现比起第一天的大约20%死亡，第二天大约有50%死亡。我估计如果是曲精小管的话死亡率会低一些，因为消化成单细胞本来就会损伤细胞。

随心

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就是这篇文章

随心

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多谢，你的意见对我很有用，不过还有一个问题时，因为我的试验样品比如睾丸需要一天内都收完，没有时间每个样本都做spread，睾丸可以冻存吗，有方法吗。多谢多谢

ying

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: {3 Q1 Q: ~8 b- Q  }& f6 S回复 随心 的帖子
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2 E; k1 t2 ]( d混有其他细胞不可以做染色H2AX和Scp3染色吗？反正非四倍体期的细胞都是染色阴性，阴性得非常厉害一点背景都没有的。四倍体期里面粗线期的Scp3非常非常亮，而且H2AX是包裹着XYbody的极其显眼的一团，粗线期细胞绝对不会和细线偶线双线期混淆的。
  V5 |" G# }8 N, K4 ?3 z我的经验是，曲精小管所有细胞一起做chromatin spread比较好做，要是分选成了纯的粗线期细胞，则需要至少10^6才能做出比较好看的图。10^5想做出来需要很有经验和技巧才行。你要是用FACS来分选的话很不容易分到10^6.用重力沉降的话肯定是不纯的，粗线期能有80%就不错了。
5 A8 D9 |! L' t6 C, O. s另外，那个给文献的童鞋文献很不给力，根本没看清楼主要什么。

随心

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你好，是这样的，我想做方面的东西，但是周围没人做过。所以只能多麻烦你了。3 y9 b/ U2 D4 L  f" `" P) w% G0 b
因为我的实验需要，当时采样时没办法直接做，如果不能冻存，现做我是没有时间的。所以就算麻烦我也要知道按照冻存的方法去做。请问你知道如何冻存吗？有文献吗或者操作步骤吗？
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再者我是想从睾丸组织中提取粗线期精母细胞，单独拿出这种细胞做涂片染色用。给您一篇文章，试验方法中有Preparation of meiotic spreads，但是他是新鲜组织的，不是冻存的。但是我也是要做SCP3和H2axa染色的。
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所以帮帮忙啦，，你知道怎么冻存吗？

490096812

可以冻存，但是太麻烦了，我们是放在PBS中加双抗，储存，几个小时没有问题，放到一个保温箱，里面放上冰袋，

随心

回复 490096812 的帖子  h4 M" {' y0 T" Z( A" f
* i. {# C/ d0 C( H  I7 Z% ]8 f
取到新鲜的睾丸组织（注意保存）
( n4 U$ ^0 u' I3 u如何保存？必须保证新鲜的组织马上开始做还是可以冻存呢？
# A) o) |! t/ n5 _+ ]谢谢