请教一个关于PCR的问题，急！

ind6562

由于我的细胞处理时间已到，现在必须提mRNA了，但因为这几天放假我们实验室逆转录的设备还不能用，要等几天。我知道mRNA很容易降解，提取之后最好立即进行逆转录，但目前条件还不允许逆转录，大家有什么办法能让我把mRNA提取出来还能保存一段时间呢？
  B3 b/ A4 Y/ C我听说可以用Trizol裂解细胞后放负80度保存就可以，等有条件了再取出进行接下来提取mRNA的步骤，这个方法效果好吗？
0 ?0 r  V+ Y' R' @) ?% l1 d* e谢谢各位大侠！

jennyshizz

这个方法可以，我实验室之前有师姐直接将细胞放在trizol然后置于-20保存的，一个月都没问题；我做实验的时候就是把RNA提取出来之后直接放在-80冻着，之后要反转录的时候再拿出来用，效果也都不错，只要动作迅速，操作过程中用DEPC水处理过的器具就ok了。

jensn

做逆转录需要特殊的设备吗？现在商用的试剂盒加上PCR仪就可以完成逆转录实验啊。至于你提到的放在-80度冰箱保存，短时间内问题是不大的，但是做mRNA的困难之处最主要在于防止你实验过程和环境中的RNA酶，因此，你需要对你所使用的任何器具和试剂进行除RNA酶，这点我觉得更关键。

weiyepan

细胞吸干了培养液直接整盘放-80度，要抽RNA的时候拿出来抽就行了。。。

ind6562

回复 weiyepan 的帖子8 G% w; k; c8 {

% A& a9 W3 M% R# m请问这样直接冻住细胞它们拿出来的时候还是贴壁着吗？

lxm5668

楼上jensn说的有道理，逆转录不需要什么专用的设备，你把试剂和逆转录试剂盒准备好就行了。如果没有准备好的话，细胞处理时间到了就马上终止培养，按照收取完整细胞的方法，轻柔的挂下细胞，用PBS洗两遍，离心转速要轻柔，800g, 2min, 以保证细胞的完整，将PBS 吸除干净，将细胞直接冻存在-80度冰箱，先不要加Trizol裂解细胞。等条件准备好了再加入Trizol裂解细胞，所用的所有物品都是DEPC水处理过的。

huangcong1988

提细胞RNA还是很简单的，用trizol提的话，您可以先用trizol裂解细胞，收集到用DEPC水处理过的离心管中，然后低温保存细胞。" b) c7 w& }+ ~& ]( H- c
之后要再提的话，直接先4度融化了，然后提就是，trizol本身就有防止RNA降解的功能（trizol跟DEPC水的作用类似，都是抑制RNA酶活性）2 T0 b# ^' B: z- n* T) p
做反转录的话，貌似不需要什么专业设备吧？一个超净台就OK了，还有就是反转录试剂盒& B. n! u$ l6 D0 M. G% @
你提的RNA直接放在负80就可以了，建议最好分装，因为反复冻融会促使RNA降解，RNA放在负80，能放很久，大概一年以后的我也用过，不过最好是现提现反转录，但是负80放一两个月再反转录还是没有问题的+ j  n9 m- U$ w8 g# Q/ |+ T# ]

weiyepan

回复 ind6562 的帖子
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' b5 U% |0 f8 o0 P  g贴壁的妥妥的，用的时候用PBS吹下来或者直接刮下来，再离下心就行了。

prophe

我们实验室试过，Trizol裂解细胞后放负80度保存一个月都可以的，mRNA在Trizol裂解液中比较稳定，即使提取mRNA后负80度保存几天都没问题的。