依然western求助

daxi-fighting@1

我做的western，有条带，但是分子量不对，我的目的条带应该在30多的位置，但是结果是在75和170左右出现了条带。请问什么原因？谢谢大家。多多帮帮啊！！

肖特

是不是抗体有交叉反应？单抗还是多抗？" i- D" P+ ~/ u
或者是材料来源的问题。
' I: k5 Z5 a6 ~( J建议从蛋白提取开始重新做一次。

xiaomao_zhoubo

嗯，同样的问题，我的结果看上去很好，没有其他杂带，可惜分子量不对

goblinwang

煮蛋白不彻底，要不你的电泳缓冲液，电泳电压与时间，问题，你胶浓度，正确吗，你得注意点细节吧，试试看

ditiger

可能是多克隆抗体，与其他蛋白有交叉~仔细阅读抗体说明书，或许能找到些答案

daxi-fighting@1

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3 o% o8 o7 x& J8 ]2 I( d) t9 e2 a9 L9 s+ V1 T; o' l
嗯，谢谢，这个抗体是多抗，是santa的，我做的是ocn的western，他的蛋白分子量是11kd，我买了只abcam的，11kd没做出来，可能是因为成骨诱导的时间不够，但是到了后来我诱导了两周，依然没做出来，所以就换了只抗体，santa的sc-30044,它说明书上的图显示的是30多的时候出现条带，结果我没做出来。
( H: _& }+ S% v, h& i

daxi-fighting@1

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嗯 那怎么办的呢？最后

daxi-fighting@1

回复 goblinwang 的帖子' h5 J7 K+ T  n5 ^) h. o  G

3 x" s2 ?# Y/ W4 J0 E蛋白我是99°eppendoff的温控摇床上煮沸五分钟。胶是配的15%的，这个是因为当时还要做一个十几kd的蛋白，所以配的15%的胶。3.03的tris，15.01的甘氨酸，200ml甲醇，800mldd水。湿转，90v，03um的pvdf膜，一个小时。其他三十多的蛋白都做出来了，唯独这个没做出来$ a# Y3 U! O0 u

daxi-fighting@1

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/ u, z5 w/ h4 s1 J5 w* J' F5 ]( }3 _8 O1 \
嗯，还是谢谢啦

weiyepan

去查查文献，看你的蛋白是不是Trimer或者Hexamer，看看自己蛋白的loading buffer里面有没有加还原剂。如果有二硫键的话没加还原剂煮都煮不开。
! j0 D- t; X  N' v另外，如果你跑的是不加SDS的电泳，恭喜你，分子量不用参考了，你的蛋白荷质比很低。