依然western求助

daxi-fighting@1

我做的western，有条带，但是分子量不对，我的目的条带应该在30多的位置，但是结果是在75和170左右出现了条带。请问什么原因？谢谢大家。多多帮帮啊！！

肖特

是不是抗体有交叉反应？单抗还是多抗？
/ g/ m3 V- `: h) u或者是材料来源的问题。+ P* R+ W# N1 s5 Q2 f
建议从蛋白提取开始重新做一次。

xiaomao_zhoubo

嗯，同样的问题，我的结果看上去很好，没有其他杂带，可惜分子量不对

goblinwang

煮蛋白不彻底，要不你的电泳缓冲液，电泳电压与时间，问题，你胶浓度，正确吗，你得注意点细节吧，试试看

ditiger

可能是多克隆抗体，与其他蛋白有交叉~仔细阅读抗体说明书，或许能找到些答案

daxi-fighting@1

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# M- m- R2 \2 i( @: }1 M
, j9 g' O* H7 s2 M' ^% O, b+ [& Z# p嗯，谢谢，这个抗体是多抗，是santa的，我做的是ocn的western，他的蛋白分子量是11kd，我买了只abcam的，11kd没做出来，可能是因为成骨诱导的时间不够，但是到了后来我诱导了两周，依然没做出来，所以就换了只抗体，santa的sc-30044,它说明书上的图显示的是30多的时候出现条带，结果我没做出来。
' U6 [+ U4 ]# t8 W/ D  E* x

daxi-fighting@1

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) U  Z: \  O( n" n
3 [$ M$ W( j- B' z' ?- T* A9 r嗯 那怎么办的呢？最后

daxi-fighting@1

回复 goblinwang 的帖子9 O( D3 [& l+ m$ p9 e

) ^; X! \4 S# T/ v( R2 {- U. u蛋白我是99°eppendoff的温控摇床上煮沸五分钟。胶是配的15%的，这个是因为当时还要做一个十几kd的蛋白，所以配的15%的胶。3.03的tris，15.01的甘氨酸，200ml甲醇，800mldd水。湿转，90v，03um的pvdf膜，一个小时。其他三十多的蛋白都做出来了，唯独这个没做出来
8 ^& m) u& _* j6 k

daxi-fighting@1

回复 ditiger 的帖子3 P9 F/ h' p1 c/ O! s  M7 q, q
! @4 L2 h$ _! p  p: t# H- u
嗯，还是谢谢啦

weiyepan

去查查文献，看你的蛋白是不是Trimer或者Hexamer，看看自己蛋白的loading buffer里面有没有加还原剂。如果有二硫键的话没加还原剂煮都煮不开。
- e6 R# [( i5 v- d1 I' }& q另外，如果你跑的是不加SDS的电泳，恭喜你，分子量不用参考了，你的蛋白荷质比很低。