求助：树突状细胞培养和DC图片

hwlightning

: ^; M6 \& W$ ]4 G& y! `( [6 ]! \3 F6 l# U( L# h' Y9 B
哪位大侠能给我传几张人外周血培养的DC细胞图片，因为我总感觉我养的DC细胞有点和理论上的DC细胞有点差异。
$ o6 X& J& T4 y8 g6 P（有人说贴壁的是单个核细胞用来诱导DC，悬浮的是淋巴细胞用来诱导CIK）可CIK不是由单个核细胞诱导的吗？. h" s& K' N, V1 Z1 v9 J
静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞会不会影响CIK细胞的培养？# Y! ?3 f. k, k8 ~5 d/ ?
上周培养DC后，悬浮的细胞诱导CIK发现很难诱导起来。
2 e8 ~' z( b, U, x6 ~100ml人外周血分离的DC细胞用75cm   培养瓶培养可行不？需要用多少培养基？
6 r4 [/ v; Y: Q+ f我看贴壁的细胞分布不均匀又吹起来让其重新均匀贴壁，这样做好不好？
4 n% H* A, _5 R静止2h后，我晃动培养基，悬浮的细胞用来培养CIK，贴壁的细胞用PBS洗涤三次（洗涤需不需要用移液器吹？），离心收集后加入CIK细胞培养瓶中。
: M8 k+ ^& M) E4 O3 m剩下的贴壁就用来养DC？: L6 z- g" W: y2 O/ a! w2 {" t+ _4 X
一顿乱做的，希望各位老大给点建设性意见1 G4 a4 j* a+ j  Y
还要注意哪些细节？& M# u4 s; R1 K. Z4 I

hwlightning

大家踊跃发言啊~~~~~小弟在这拜谢~~

get0715

1、静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞悬浮的细胞继续诱导CIK，个人认为基本不会有影响。* f. V5 z% N. Z; x
2、我觉得你在细胞培养中有点“粗暴”，因为贴壁不均就吹打起来重新贴，这种机械吹打应越少越好，更何况是你把已经贴壁的细胞硬生生的又吹下来。7 w# f$ y/ s  R5 [" H8 D  T
3、贴壁细胞在洗的时候应该避免用移液管直接吹，如果是瓶，最好将细胞瓶有细胞贴壁的一面朝上，加入的PBS，再翻转过来，让液体在细胞上过几次再倒出来。
2 I: R5 a1 G. p$ f& w% M% w" [6 L4、100mL外周血一般用75的瓶子培养是可以的，只要在分离的时候丢失的细胞别太多就行了。* x1 Y$ W, B3 L7 @+ I; h
能回答的问题就这么多了，希望对你有帮助吧。

hwlightning

回复 get0715 的帖子
  w! ^. _# A, i" U: u& d
) n+ q' C8 I' R! g7 d6 I谢谢get0715 / d& }5 D& P  d
因为是我第一次培养很多细节还不清楚，所以有点“粗暴”，呵呵0 ^4 W7 S4 f8 o) g  k2 v/ @' X
DC细胞是半贴壁细胞吧，半量换液会不会对细胞有损失，可不可一离心后继续重悬后培养？
( v1 E) f8 n3 u( y昨天观察细胞还有些集落状细胞，加入TNF刺激后今天观察贴壁的都变成长条形，细长的那种。也有些细胞长出了刺突状，有点像传说中的DC。就是不知道细长型的那些细胞是什么，也是DC？* L0 a4 k, T6 u& W3 z" `
明天拍了图片我再上传，帮我看看是不是DC。谢谢

jiguojie87

单核细胞树突状细胞培养：& Y- Q' S2 @9 l" x0 ^. y
1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
* F# s( R: S# Q! T5 [6 H2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基货号BW12002。
2 d' K& O" C* @8 W$ w( U  Y2 ~# s3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时。
, m! h4 A/ L( X, {/ @4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。
& [2 P, ~4 l8 ]: I. x) m4 ~5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。. [  b9 |8 c! o6 }4 w* O
6、往免疫细胞无血清培养基添加50至100 ng / mL的重组人IL-4和50 ng / mL的重组人GM-CSF。细胞密度应介于1~3x105细胞/ mL之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。
; Q# J( k4 Y% ~; ?, h" x2 K7、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中连续孵育5天。培养3天左右换液。同时添加IL-4和GM-CSF。! h- I  m6 u5 `3 s2 S
8、 6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a，CD80，CD86，HLA-DR）。9 F+ f$ ^# `* }  i
9、向培养基中添加1μg/ mL的LPS或者50μl/mL的TNF-α诱导的树突状细胞的成熟。! P5 w: G6 k" B8 T. C1 i
注：对于贴壁单核细胞也可以被磁珠分离。' s: g5 T  s/ R# I/ y% _+ e' [

jiguojie87

是的

lyj-0017

回复 hwlightning 的帖子. m; G7 Y$ w: H" H" n- r# Y
0 H8 N2 s/ C  V
首先你是概念不清，单个核细胞指的用淋巴细胞分离液分离细胞时的白膜层，是一群细胞，应将单个核细胞与单核细胞两个概念区分开。首先将单个核细胞加入培养瓶或皿中，过夜后分离悬浮细胞用于诱导CIK细胞，这主要是由悬浮的淋巴细胞进行诱导的；贴壁的单核细胞-巨噬细胞用来诱导DC细胞。
% `/ `! ]' X* l( R再一个，DC的树突一般肉眼是看不到的，你看到的所谓的细胞突触应该是一些间质细胞，而不一定是树突状细胞。

永远的伊凡

静置2h后，分离DC、CIK时轻轻晃动3-5下即可，不可用力过猛或吹打；已经贴壁的细胞就继续培养，不要再吹打起来了，注意静置时摇匀就行。