求助：树突状细胞培养和DC图片

hwlightning

- N7 `% ]/ p# H+ E( {% ]
8 i) \4 C' \+ f+ \  p7 y% A
哪位大侠能给我传几张人外周血培养的DC细胞图片，因为我总感觉我养的DC细胞有点和理论上的DC细胞有点差异。
- j; S7 x) d% F- ?( g（有人说贴壁的是单个核细胞用来诱导DC，悬浮的是淋巴细胞用来诱导CIK）可CIK不是由单个核细胞诱导的吗？
3 E/ z' B" q5 h1 B- b! z静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞会不会影响CIK细胞的培养？' g. C3 ~( k% z3 F- x4 c
上周培养DC后，悬浮的细胞诱导CIK发现很难诱导起来。
# y* J( ]' o- A: N5 ~9 x100ml人外周血分离的DC细胞用75cm   培养瓶培养可行不？需要用多少培养基？
1 s6 @& V. T1 G" h3 i) Q我看贴壁的细胞分布不均匀又吹起来让其重新均匀贴壁，这样做好不好？
  y; s8 z9 I0 O3 s静止2h后，我晃动培养基，悬浮的细胞用来培养CIK，贴壁的细胞用PBS洗涤三次（洗涤需不需要用移液器吹？），离心收集后加入CIK细胞培养瓶中。
8 i$ J2 {1 W% c3 X9 Q剩下的贴壁就用来养DC？4 I3 z* V% t8 M$ f" j
一顿乱做的，希望各位老大给点建设性意见
: A, _+ k+ I* x. Y& v' Q还要注意哪些细节？
* c9 q% N( g: f7 U5 Q2 |+ E# X

hwlightning

大家踊跃发言啊~~~~~小弟在这拜谢~~

get0715

1、静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞悬浮的细胞继续诱导CIK，个人认为基本不会有影响。
* ]) h0 I3 ^7 H# N2、我觉得你在细胞培养中有点“粗暴”，因为贴壁不均就吹打起来重新贴，这种机械吹打应越少越好，更何况是你把已经贴壁的细胞硬生生的又吹下来。9 ?) M7 v3 Z) @
3、贴壁细胞在洗的时候应该避免用移液管直接吹，如果是瓶，最好将细胞瓶有细胞贴壁的一面朝上，加入的PBS，再翻转过来，让液体在细胞上过几次再倒出来。' G9 l( d6 s! X. |4 M
4、100mL外周血一般用75的瓶子培养是可以的，只要在分离的时候丢失的细胞别太多就行了。
3 c9 b1 u* o7 q- D- Q! ?9 D! e能回答的问题就这么多了，希望对你有帮助吧。

hwlightning

回复 get0715 的帖子9 w* P7 ]4 D) V/ _! I+ b8 S8 y3 S# x
+ T0 v$ I8 U! \
谢谢get0715 ) k+ G2 c. u6 m0 c) ^# H1 [
因为是我第一次培养很多细节还不清楚，所以有点“粗暴”，呵呵
; w" n# ?/ K/ R4 i( c& n3 VDC细胞是半贴壁细胞吧，半量换液会不会对细胞有损失，可不可一离心后继续重悬后培养？
7 ~( L6 o) ?9 h, z$ X昨天观察细胞还有些集落状细胞，加入TNF刺激后今天观察贴壁的都变成长条形，细长的那种。也有些细胞长出了刺突状，有点像传说中的DC。就是不知道细长型的那些细胞是什么，也是DC？
9 @1 l5 P0 Q, F% j2 E9 [' L) b明天拍了图片我再上传，帮我看看是不是DC。谢谢

jiguojie87

单核细胞树突状细胞培养：
- @7 F" b( C" ]1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
. U- Z4 R/ G6 o1 ~  |5 z; x2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基货号BW12002。" f- x( g" |# H; i! X3 y+ u
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时。  b! q9 _* L8 V" K& k
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。
* n# Z/ r) G7 Z4 p6 G, g  R5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。! J/ U. l! s, ~* {2 ]
6、往免疫细胞无血清培养基添加50至100 ng / mL的重组人IL-4和50 ng / mL的重组人GM-CSF。细胞密度应介于1~3x105细胞/ mL之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。
' O3 ^% X, [1 O7、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中连续孵育5天。培养3天左右换液。同时添加IL-4和GM-CSF。
3 ]$ K& @; Z- Y8、 6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a，CD80，CD86，HLA-DR）。
, f/ f$ E4 H; i# A9、向培养基中添加1μg/ mL的LPS或者50μl/mL的TNF-α诱导的树突状细胞的成熟。) B% o5 J5 k6 v/ u5 R4 k
注：对于贴壁单核细胞也可以被磁珠分离。
' M8 F- q3 h' w# v/ O' k( B

jiguojie87

是的

lyj-0017

回复 hwlightning 的帖子
: C( Q' N: v- k5 x5 g  n9 g/ n3 ~0 Z% c& @( w. D
首先你是概念不清，单个核细胞指的用淋巴细胞分离液分离细胞时的白膜层，是一群细胞，应将单个核细胞与单核细胞两个概念区分开。首先将单个核细胞加入培养瓶或皿中，过夜后分离悬浮细胞用于诱导CIK细胞，这主要是由悬浮的淋巴细胞进行诱导的；贴壁的单核细胞-巨噬细胞用来诱导DC细胞。
3 o- \% N) \& A再一个，DC的树突一般肉眼是看不到的，你看到的所谓的细胞突触应该是一些间质细胞，而不一定是树突状细胞。

永远的伊凡

静置2h后，分离DC、CIK时轻轻晃动3-5下即可，不可用力过猛或吹打；已经贴壁的细胞就继续培养，不要再吹打起来了，注意静置时摇匀就行。