求助：树突状细胞培养和DC图片

hwlightning

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哪位大侠能给我传几张人外周血培养的DC细胞图片，因为我总感觉我养的DC细胞有点和理论上的DC细胞有点差异。: R# j, X6 k7 T0 n3 E( I( y
（有人说贴壁的是单个核细胞用来诱导DC，悬浮的是淋巴细胞用来诱导CIK）可CIK不是由单个核细胞诱导的吗？
+ _  L) b; e4 E* K; c- i静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞会不会影响CIK细胞的培养？3 C- o% r5 f2 E
上周培养DC后，悬浮的细胞诱导CIK发现很难诱导起来。( h7 V9 i. f  Y2 s
100ml人外周血分离的DC细胞用75cm   培养瓶培养可行不？需要用多少培养基？
% |! a+ E6 u3 N4 `5 `! s我看贴壁的细胞分布不均匀又吹起来让其重新均匀贴壁，这样做好不好？( \( b  Y! \# W1 B
静止2h后，我晃动培养基，悬浮的细胞用来培养CIK，贴壁的细胞用PBS洗涤三次（洗涤需不需要用移液器吹？），离心收集后加入CIK细胞培养瓶中。( V  h; Y3 V  w/ B5 ?
剩下的贴壁就用来养DC？. s1 j8 ^$ s2 L( H  C
一顿乱做的，希望各位老大给点建设性意见9 w+ C/ Z5 r5 ]
还要注意哪些细节？9 C4 \4 q9 V8 l2 Y6 y4 ]+ s$ q

hwlightning

大家踊跃发言啊~~~~~小弟在这拜谢~~

get0715

1、静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞悬浮的细胞继续诱导CIK，个人认为基本不会有影响。+ [/ z$ b5 ]: [
2、我觉得你在细胞培养中有点“粗暴”，因为贴壁不均就吹打起来重新贴，这种机械吹打应越少越好，更何况是你把已经贴壁的细胞硬生生的又吹下来。
. V5 d$ |' ^+ |: _* D- Z3 V) T$ N3、贴壁细胞在洗的时候应该避免用移液管直接吹，如果是瓶，最好将细胞瓶有细胞贴壁的一面朝上，加入的PBS，再翻转过来，让液体在细胞上过几次再倒出来。/ g6 N( n# b" J/ q$ e' H
4、100mL外周血一般用75的瓶子培养是可以的，只要在分离的时候丢失的细胞别太多就行了。
# _' {$ a. I9 ]- H能回答的问题就这么多了，希望对你有帮助吧。

hwlightning

回复 get0715 的帖子( M( g  ]. F* [- Y5 u+ ]6 j

$ n. x- J: ?  Q- P. E谢谢get0715 , I4 k/ s; C# k5 g% d8 o- \
因为是我第一次培养很多细节还不清楚，所以有点“粗暴”，呵呵
8 j/ t9 K. }6 }1 ~2 LDC细胞是半贴壁细胞吧，半量换液会不会对细胞有损失，可不可一离心后继续重悬后培养？
$ S$ w# q$ B# I& T; [: t6 m昨天观察细胞还有些集落状细胞，加入TNF刺激后今天观察贴壁的都变成长条形，细长的那种。也有些细胞长出了刺突状，有点像传说中的DC。就是不知道细长型的那些细胞是什么，也是DC？; B& g' V, N& R1 ~5 i
明天拍了图片我再上传，帮我看看是不是DC。谢谢

jiguojie87

单核细胞树突状细胞培养：; c( A8 k1 e* R1 ?- ]* o4 i
1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
# {4 V8 Z: F# V. g3 l2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基货号BW12002。' i" k% ^* L$ o
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时。0 C$ j4 x0 Q1 H
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。
& F5 z& Y9 S3 _1 }6 p$ t0 p5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。# K& Z' \& T6 A! l7 i& B& I* n
6、往免疫细胞无血清培养基添加50至100 ng / mL的重组人IL-4和50 ng / mL的重组人GM-CSF。细胞密度应介于1~3x105细胞/ mL之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。
* d: F; i$ t+ P; }* |7、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中连续孵育5天。培养3天左右换液。同时添加IL-4和GM-CSF。; [1 Y. A/ |, A# K
8、 6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a，CD80，CD86，HLA-DR）。$ }3 @6 F" {; q2 I. P1 A/ _3 c
9、向培养基中添加1μg/ mL的LPS或者50μl/mL的TNF-α诱导的树突状细胞的成熟。
. j" U5 B* B" r8 B; A- D, W4 ` 注：对于贴壁单核细胞也可以被磁珠分离。
6 a$ _% v7 S: S# ]' ^. P! y9 [

jiguojie87

是的

lyj-0017

回复 hwlightning 的帖子& M4 b2 \2 Z3 ]. K) M) l7 e

+ a4 J# z# L! P! e首先你是概念不清，单个核细胞指的用淋巴细胞分离液分离细胞时的白膜层，是一群细胞，应将单个核细胞与单核细胞两个概念区分开。首先将单个核细胞加入培养瓶或皿中，过夜后分离悬浮细胞用于诱导CIK细胞，这主要是由悬浮的淋巴细胞进行诱导的；贴壁的单核细胞-巨噬细胞用来诱导DC细胞。
7 y! ]) y9 S/ i3 H2 t  m( W再一个，DC的树突一般肉眼是看不到的，你看到的所谓的细胞突触应该是一些间质细胞，而不一定是树突状细胞。

永远的伊凡

静置2h后，分离DC、CIK时轻轻晃动3-5下即可，不可用力过猛或吹打；已经贴壁的细胞就继续培养，不要再吹打起来了，注意静置时摇匀就行。