求助：树突状细胞培养和DC图片

hwlightning

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1 I7 h3 }+ a6 I2 L" c" A  d哪位大侠能给我传几张人外周血培养的DC细胞图片，因为我总感觉我养的DC细胞有点和理论上的DC细胞有点差异。/ x; j; O8 K. |
（有人说贴壁的是单个核细胞用来诱导DC，悬浮的是淋巴细胞用来诱导CIK）可CIK不是由单个核细胞诱导的吗？
. a3 N; u5 K% D& s8 y静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞会不会影响CIK细胞的培养？
& Q: [% Q( C4 v9 ~* u0 R/ \8 k: {上周培养DC后，悬浮的细胞诱导CIK发现很难诱导起来。* b& e# \' i8 ]  F8 Z4 i
100ml人外周血分离的DC细胞用75cm   培养瓶培养可行不？需要用多少培养基？( t/ H# h$ o3 A" s
我看贴壁的细胞分布不均匀又吹起来让其重新均匀贴壁，这样做好不好？
% W, ]% {, G# }1 H% q7 [静止2h后，我晃动培养基，悬浮的细胞用来培养CIK，贴壁的细胞用PBS洗涤三次（洗涤需不需要用移液器吹？），离心收集后加入CIK细胞培养瓶中。, x+ q& W# y) s1 d5 a
剩下的贴壁就用来养DC？
7 ^# ~& U( l; ?# ]& E" J0 }一顿乱做的，希望各位老大给点建设性意见4 o0 {6 Z2 k# k8 @; y/ r/ Q0 F
还要注意哪些细节？
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hwlightning

大家踊跃发言啊~~~~~小弟在这拜谢~~

get0715

1、静止2H后，贴壁的用来培养DC细胞悬浮的细胞继续诱导CIK，个人认为基本不会有影响。
8 w/ c5 {! u& w& H6 l2、我觉得你在细胞培养中有点“粗暴”，因为贴壁不均就吹打起来重新贴，这种机械吹打应越少越好，更何况是你把已经贴壁的细胞硬生生的又吹下来。
2 |0 y8 ?7 ^3 X3、贴壁细胞在洗的时候应该避免用移液管直接吹，如果是瓶，最好将细胞瓶有细胞贴壁的一面朝上，加入的PBS，再翻转过来，让液体在细胞上过几次再倒出来。
7 x4 y5 k& @) {9 \- i4、100mL外周血一般用75的瓶子培养是可以的，只要在分离的时候丢失的细胞别太多就行了。
8 `# T5 H  }9 l- B# W1 `& ^' o: Q; Q能回答的问题就这么多了，希望对你有帮助吧。

hwlightning

回复 get0715 的帖子
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谢谢get0715 6 b' f& C5 h  P  e  p9 S' s
因为是我第一次培养很多细节还不清楚，所以有点“粗暴”，呵呵
6 P2 }- G- z3 P3 z7 Z$ W7 M3 D% o$ ?DC细胞是半贴壁细胞吧，半量换液会不会对细胞有损失，可不可一离心后继续重悬后培养？6 z) ^! r5 J! ~( `- T
昨天观察细胞还有些集落状细胞，加入TNF刺激后今天观察贴壁的都变成长条形，细长的那种。也有些细胞长出了刺突状，有点像传说中的DC。就是不知道细长型的那些细胞是什么，也是DC？
  O" w! A9 S' y( t% Y" D明天拍了图片我再上传，帮我看看是不是DC。谢谢

jiguojie87

单核细胞树突状细胞培养：
7 k; ?2 B' V' R/ B% e' _1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。. }9 q5 V# M$ ]5 l7 o# g; ^* J
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基货号BW12002。. t; \% C" L/ Y$ j+ m8 z4 E5 E
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时。* K3 R" m3 W3 o5 F# A$ o' A
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。& I/ j8 D* {. C1 X7 b- _' \1 Y
5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。2 \: W2 _7 O9 p" W7 d; S
6、往免疫细胞无血清培养基添加50至100 ng / mL的重组人IL-4和50 ng / mL的重组人GM-CSF。细胞密度应介于1~3x105细胞/ mL之间。研究者可视情况加入灭活的人自体血浆。5 V  @) |: Q$ f  j( f
7、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中连续孵育5天。培养3天左右换液。同时添加IL-4和GM-CSF。
" c/ T4 u# }3 G8、 6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a，CD80，CD86，HLA-DR）。
8 ^' U, a, ^5 o9、向培养基中添加1μg/ mL的LPS或者50μl/mL的TNF-α诱导的树突状细胞的成熟。
- Z3 o( @8 [1 v+ |$ a9 E6 D 注：对于贴壁单核细胞也可以被磁珠分离。
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jiguojie87

是的

lyj-0017

回复 hwlightning 的帖子. X7 U  g& q! i0 \' e9 F% Z
" V5 b6 o8 B7 u0 ~
首先你是概念不清，单个核细胞指的用淋巴细胞分离液分离细胞时的白膜层，是一群细胞，应将单个核细胞与单核细胞两个概念区分开。首先将单个核细胞加入培养瓶或皿中，过夜后分离悬浮细胞用于诱导CIK细胞，这主要是由悬浮的淋巴细胞进行诱导的；贴壁的单核细胞-巨噬细胞用来诱导DC细胞。
7 l" e1 o0 Q9 @, T5 `7 q8 y再一个，DC的树突一般肉眼是看不到的，你看到的所谓的细胞突触应该是一些间质细胞，而不一定是树突状细胞。

永远的伊凡

静置2h后，分离DC、CIK时轻轻晃动3-5下即可，不可用力过猛或吹打；已经贴壁的细胞就继续培养，不要再吹打起来了，注意静置时摇匀就行。