求hES制EB的方法

hjd8886

1：matrigel上的H1培养密度多大的时候消化？用几X的dispase？消化几分钟？用什么培养基？0 {( Z# y" U7 e1 B
2：feeder上的H1要培养密度多大的时候消化？用多少浓度的胶原酶消化？消化多久？用什么培养基？- Y5 o  @0 G7 C; {$ V
最近想做EB了，没有详细的protocol，各位大神们帮帮忙啊，小弟拜谢啦。

pipi168

eb的outline protocol 有很多的，但是细节决定成败，人家的经验不会给你，你要自己探索。

hjd8886

回复 pipi168 的帖子" {5 Y( D6 W/ Q' e' q1 K4 e# l

0 B6 e0 @- l/ W你说话的语气好像我师姐啊

wbj1983

回复 hjd8886 的帖子; B3 `1 ~) K9 G
9 s& A* b; V9 Z
1、您好！如果您现在养H1的话这个问题很简单，消化时间和胶原酶浓度就是你平时培养H1用的一样。5 Z' j. z6 u) Y  c+ n% [9 S1 r
2、至于用什么培养基：看您是定向分化还是随机分化，看您的用途。定向分化是需要加外源因子的，随机分化就用不同成纤维细胞培养基就可以。! I2 D, |- |/ m( \5 e' i5 O
3、消化时候的细胞密度问题：一般80-90%汇合度，你如果要是没养过H1的话先培养一段时间练练手吧，H1都养不好的情况下做分化我觉得不太合理，小弟加油！

hjd8886

回复 wbj1983 的帖子/ B4 x: a& h$ l% W$ L' u

4 O/ O# z9 @) `$ _6 L7 f灰常感谢啊，哈哈！7 k5 i/ r; t' u* o! Y( M
用6 wells在matrigel上培养H1P50细胞，待细胞密度达到70-80%，先用F12 1ml洗一次，然后用2 x dispase消化5 min，使克隆边缘卷起，用F12洗三次，接着用KSR-bFGF培养基轻轻刮成大块；把2-3孔中的细胞转移到一个培养瓶中（为保证实验的准确性可以把一个孔中的细胞平均分到培养瓶中），37°悬浮培养过夜，第二天检查成球状态。悬浮培养4-8天后，再贴matrigel培养4-8天，此时用KSR-bFGF培养基，然后用accutase彻底消化细胞10min,使成单细胞，计数。; C: e1 i5 I! y* E. ?
麻烦您帮我看看我设计的步骤可行不？ 谢谢啊

wbj1983

回复 hjd8886 的帖子" n" U: J5 v* _2 S! q, E
3 j+ p" r! x( ?% `; t  P1 v) R- p
问题应该不大，记得：终止消化一定用含有FBS的培养基，不要用KSR！KSR终止消化是不太好的！

hjd8886

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, U: W0 r$ J1 m& a$ N0 }受教了，再次拜谢啊