求hES制EB的方法

hjd8886

1：matrigel上的H1培养密度多大的时候消化？用几X的dispase？消化几分钟？用什么培养基？0 i0 p+ @/ l9 O9 O% [2 ?: \
2：feeder上的H1要培养密度多大的时候消化？用多少浓度的胶原酶消化？消化多久？用什么培养基？
% Y  Y6 r4 y3 B  @; V3 _6 p; d最近想做EB了，没有详细的protocol，各位大神们帮帮忙啊，小弟拜谢啦。

pipi168

eb的outline protocol 有很多的，但是细节决定成败，人家的经验不会给你，你要自己探索。

hjd8886

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7 q: H# k4 h& q& P: x' |你说话的语气好像我师姐啊

wbj1983

回复 hjd8886 的帖子5 |3 w/ f: X5 A+ m

1 r  W, ~+ c7 k! ^$ l; p1、您好！如果您现在养H1的话这个问题很简单，消化时间和胶原酶浓度就是你平时培养H1用的一样。0 s& y5 C$ j( P  d  U9 B; n
2、至于用什么培养基：看您是定向分化还是随机分化，看您的用途。定向分化是需要加外源因子的，随机分化就用不同成纤维细胞培养基就可以。( ?! Y% K, Y  U& i/ `: D  L
3、消化时候的细胞密度问题：一般80-90%汇合度，你如果要是没养过H1的话先培养一段时间练练手吧，H1都养不好的情况下做分化我觉得不太合理，小弟加油！

hjd8886

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2 v* ~; @) _1 d( _$ d
4 l3 W% t* ]/ V8 k( I/ v. W$ L1 ^灰常感谢啊，哈哈！
2 R) B$ M6 x: e5 U4 E+ F1 ?$ p( I, \  R用6 wells在matrigel上培养H1P50细胞，待细胞密度达到70-80%，先用F12 1ml洗一次，然后用2 x dispase消化5 min，使克隆边缘卷起，用F12洗三次，接着用KSR-bFGF培养基轻轻刮成大块；把2-3孔中的细胞转移到一个培养瓶中（为保证实验的准确性可以把一个孔中的细胞平均分到培养瓶中），37°悬浮培养过夜，第二天检查成球状态。悬浮培养4-8天后，再贴matrigel培养4-8天，此时用KSR-bFGF培养基，然后用accutase彻底消化细胞10min,使成单细胞，计数。
5 Z( X- x6 _2 C; V- p$ R! S麻烦您帮我看看我设计的步骤可行不？ 谢谢啊

wbj1983

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/ }7 ?4 \! B. B0 X3 M
: |$ S6 p# s3 I; u3 ]. r& {问题应该不大，记得：终止消化一定用含有FBS的培养基，不要用KSR！KSR终止消化是不太好的！

hjd8886

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: `. Y+ t6 q* p' O5 i% x# }
+ K( f/ f# O% V2 J% r" Z受教了，再次拜谢啊