免疫荧光技术的疑问

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1.固定通常是取材后放到4℃固定，没有那个条件室温固定也是可以的。病理实验室没有37℃固定的。
7 V- \6 ?# a& v+ Z) x3 t/ Z2.triton（曲拉通）的目的给细胞打孔，让抗体进入细胞内部，如果抗原在细胞表面，没有必要加这个试剂。通常是先打孔，再封闭非特异性抗原，封闭的试剂通常是在加入一抗之前。如果楼主用心，可以在这个步骤加入一个平行的对照试验。加入一个切片即可看到对比效果。至于温度，曲拉通在10℃左右都可以打孔，所以不用担心温度。封闭温度也在室温进行，无需37℃，在37℃下封闭的结果有可能得到相反的结果。- c, s/ `# F, w$ G+ |1 K  f
3.triton的打孔作用很强，tween试剂在免疫反应中应用不多。根据操作者的实验结果而定，如果细胞内的抗原显色效果不强，可以考虑曲拉通，打孔后的显色效果非常好（曲拉通是有毒试剂，对眼睛尤其有害。操作时小心）。
( @% h0 f! w* I% \: ~4.一抗的稀释液2者作用相似，结果没有多大区别，个人偏好PBS。理由是封闭液其实是蛋白质溶液，与一抗还是有竞争作用的，如果一抗的稀释倍数很低，在用封闭液，可能影响实验结果，出现假阴性的实验结果。这个楼主小心了。& l7 u* ^: a$ M- h. M  c
5.37℃孵育抗体会影响反应速度，冬天，二抗通常在37摄氏度下反应1个小时；夏天在室温即可。如果楼主不放心，无论季节，都在37摄氏度下反应二抗是正确的。: h4 ?# v3 }0 S3 T. J" [( G" w
6.以上的实验条件都属于抗体反应的优化，楼主根据自己的情况来调节把握。