为什么取的原代神经干细胞感觉增殖不行呀？

小渝

本人最近一直在取SD大鼠E14.5天的胎鼠大脑皮层神经干细胞，但是感觉增殖不明显，而且一般第二天会有很多贴壁分化，然后我就换瓶，收集培养液内未贴壁的细胞继续培养，但是感觉成球的比较少，感觉基本看不到明显的增殖，而且传一代感觉就不行了，我的培养液是DMEM/F12+B27+EGF+bFGF+谷氨酰胺，求大神指教呀！

ruth891005@yaho

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受教了，非常感谢

rhmm

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6 h. O7 T- n1 s6 `  l9 `& d
, ]' M6 B9 g7 \9 c1.纯机械吹打一方面对细胞伤害也很大，另外一方面很难形成单细胞悬液，组织块没有那么容易吹散，你说的方法我开始也试过，但是最后还是觉得两者结合比较好。
4 i8 L9 G: ~5 {% M2 f/ N  d4 e3 t0 K0 `% B2. 解剖显微镜很有必要，脑膜剥不干净的话，杂志会很多，脑膜血管中那些血细胞什么的，直接会影响球体的形成。. m/ F  J1 U) B  `3 T; _9 F
实验就是这样，你小心翼翼都不一定可以做好，更何况缺这少那的，要不得，加油啊

小渝

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$ ^' v7 K( C; s& t+ A不用买什么呀，就是准备生理盐水，一次性巴氏滴管（塑料）或者移液枪，一般的载玻片和盖玻片就行了。具体的操作很多文献上都有介绍。就是在合笼的第二天早上用滴管吸取适量生理盐水轻柔冲洗雌鼠阴道，然后滴在载玻片上，至于放不放盖玻片就看你自己了，我是觉得盖上会比较好观察一点。然后在镜下观察是否有精子。如果有也只能说明有交配行为不能说一定怀孕。要观察怀孕的话可以连续几天测雌鼠的体重，因为如果受孕，在合笼后的几天后你会发现其体重增加较快，也很明显。涂片根据文献自己琢磨，然后体重监测是根据个人经验滴，希望对你有帮助，你可以多看看文献。

shxwang

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请教阴道涂片在哪里买？我每次合笼都无法判断老鼠是否交配成功，谢谢~

zb_ming

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像我做多了现在不怎么看时间了，因为：1、各个阶段都可以培养出来神经干细胞。2、我现在不是以培养神经干细胞为主了，是用来诱导的。3、原来确定时间有：看阴栓，要费点心；引导图片相对容易点；周期性合拢，有一点误差要细心。

小渝

回复 rhmm 的帖子2 u1 L2 m7 ?) s! V+ L
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谢谢您的回复。1.我不用胰酶，因为胰酶对于神经干细胞来说伤害比较大；2.我是要么是纯机械吹打，要么是用TrypLE进行消化，吹打力度感觉是比较温和了；3.我确定是E14.5d，因为我是晚上合笼，白天分开，而且不是每天都合，早上阴道涂片；4.确定因子是加够了的，分装神马的是跟好几个人核对了没有问题，储存室严格按照说明书进行的，也肯定在有效期内；5.取材的时候我们这条件有限没有解剖显微镜，所以这个方面的原因。。。。。。。。

小渝

回复 zb_ming 的帖子7 T  k. z5 y: a1 v, [# O- j" L( N+ V( B
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想请教下您是怎样确定时间的呀？

zb_ming

回复 小渝 的帖子: V! _- K! ]: U; X' E- O
( P* ~' }0 t8 E
E14.5--16.5d

rhmm

1. 胰酶消化时间是不是合适，根据取材多少胰酶的量要随着变化 2.吹打了没有，吹打力度过大也影响活性 3 你确定是孕14.5天的？？？ 4 bFGF加的量够不够，20ng/ml 如果是对的，那分装的时候有没有计算错，试剂的有效期及存放条件对不对 5 取材时一定要拨净脑膜及血管，开始几次肯定不熟练儿拨不干净，时间长了可以一两下就拨干净的 目前能想到的就只有这些