为什么取的原代神经干细胞感觉增殖不行呀？

小渝

本人最近一直在取SD大鼠E14.5天的胎鼠大脑皮层神经干细胞，但是感觉增殖不明显，而且一般第二天会有很多贴壁分化，然后我就换瓶，收集培养液内未贴壁的细胞继续培养，但是感觉成球的比较少，感觉基本看不到明显的增殖，而且传一代感觉就不行了，我的培养液是DMEM/F12+B27+EGF+bFGF+谷氨酰胺，求大神指教呀！

湖南干细胞

有问题还得描述得更清楚点或许会有大侠回应，当然最好去看看别人的帖子，然后看看谁做这一块，然后向他们提问，多半会得到解答，最近感觉人气不是很旺。

细胞海洋

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4 G! Q# I7 Q: G6 y/ C, V周末 再耐心等待一下

kudy

我们养的 新生3D 的SD大鼠  一般不贴壁  吹打不要太猛

zb_ming

首先祝贺楼主进入干细胞培养行列，咱们同行。在回答楼主问题之前想问问楼主：你怎么去确定你所用胚鼠就是E14.5D的呢？哈哈请教。% `) f% I. c4 X7 M  E; z
再来回答楼主问题，根据我多年培养神经干细胞的经验：1、现在应该是细胞培养的白银时期，因为过了4、5月份和9、10月份的黄金时期。这里楼主可以知道，细胞培养是受天气影响的啊，哈哈。2、作为新手要面对很多突如其来的新问题，这是每位新手都必经之路，我也不例外，但记住一点：就是永不言败，手勤脑勤，多思考多动手多看文献。3、神经干细胞培养的每一步骤要做到烂熟于心，这样出问题了才好一步步去找原因。4、楼主取材时脑皮层不可贪多，关键问题是脑膜和血管要剥离清除干净这个很影响细胞状态。5、细胞分散不知楼主采用哪种方法：胰酶消化法需要经验十分成熟者使用，时间很不好掌握，我到现在都不敢用。用不好对细胞影响很大。6、我是用的是物理方法，吸管吹打发，但也要掌握好度。7、培液因子要现用现加。8、避免污染，很关键。9、观察细胞要轻拿轻放，避免粘连。10、要及时换页，营养跟上。11、楼主所说的贴严重的话是细胞生存环境不利造成的，不适宜其生长，因此才会贴壁。暂时想到这么多，希望多和楼主交流，祝好运！

小渝

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7 e$ A. L& q5 C- y  s& K/ m; F! ]' G
首先非常感谢您的回复，获益匪浅，帮助我理清头绪。E14.5d根据文献资料是晚上合笼，第二天早上进行阴道涂片（因为大鼠阴栓容易脱落），如果涂片见精子我们就记为0.5d，这样计算天数的。另外我分散细胞根据文献权衡了下，机械吹打和酶(TrypLE)消化都在用，生长因子都是现用现加的，每2到3天进行半量换液。9 A1 |; e0 S9 }
另外想请教下您用的是哪个时期的大鼠取材呀？

rhmm

1. 胰酶消化时间是不是合适，根据取材多少胰酶的量要随着变化 2.吹打了没有，吹打力度过大也影响活性 3 你确定是孕14.5天的？？？ 4 bFGF加的量够不够，20ng/ml 如果是对的，那分装的时候有没有计算错，试剂的有效期及存放条件对不对 5 取材时一定要拨净脑膜及血管，开始几次肯定不熟练儿拨不干净，时间长了可以一两下就拨干净的 目前能想到的就只有这些

zb_ming

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8 f; C" M9 }3 Z% H  I/ H" N- F; T2 R5 b$ A* f6 W5 J
E14.5--16.5d

小渝

回复 zb_ming 的帖子5 e+ b+ h4 j! ]( E+ S) y: `) V# u- F  {
- l) U, P- l( O- W5 P+ ^& Y9 \
想请教下您是怎样确定时间的呀？

小渝

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: r. a9 c" q/ H
, y- d) I, u4 J7 x谢谢您的回复。1.我不用胰酶，因为胰酶对于神经干细胞来说伤害比较大；2.我是要么是纯机械吹打，要么是用TrypLE进行消化，吹打力度感觉是比较温和了；3.我确定是E14.5d，因为我是晚上合笼，白天分开，而且不是每天都合，早上阴道涂片；4.确定因子是加够了的，分装神马的是跟好几个人核对了没有问题，储存室严格按照说明书进行的，也肯定在有效期内；5.取材的时候我们这条件有限没有解剖显微镜，所以这个方面的原因。。。。。。。。