DNA甲基化分析的心得---新人第一帖---求分，求谅解！！！

Andyhigh

最近在试着做DNA甲基化分的分析，希望和大家分享下！用的方法是亚硫酸氢钠法（BSP）
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大致步骤：3 v& W- }+ g" F2 Y5 m4 s
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1.甲基化引物的设计-这是重中之重，直接关系到后面试验的成败，引物是别人帮我设计的。一些基本原则:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物
- K! g% K  E( w, C$ R; Q. X) J   应包含尽可能多的CpG位点。附件里面也有一些资料
4 @7 t; q( ?- L; K2.DNA的提取，我用的是试剂盒，按照上面的步骤来的。; h# G; P4 o+ j+ [: X& E' r
3.BS的处理：其中有一个很关键的地方就是BS处理的时间问题：太长会使目的片段断裂，然而时间太短会使变性不充分。经过不同时间处理梯度试验（4 8 12 16h），发现十六小时不错，  & Z& H0 K% U/ A: n( d. H
   我的目的片段在200bp左右。
6 B6 m- A+ _' u( h4.PCR的问题:对于不同目的基因的目的目片段Tm值有可能不一样，这也需要自己摸索。
1 r) K' d; F+ ~# r# L5.琼脂糖凝胶电泳：基本原理及注意事项见附件
( f& A8 T; b) I/ I6.载体构建和转染：用的也是试剂盒。" g  }5 J9 e- i! S6 {
7.挑选单菌落:通过菌液PCR产物跑胶和小摇转染后的大肠杆菌，双重选择阳性克隆。4 q4 U% {: n- J9 R0 ?, ]! ?/ \
8.测序和后续的结果分析, H* s) E6 V8 E; B  F, k
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大致步骤就是上述的，求高手指点，尤其是那些做个的人，谈谈实验中应该注意的东东，自己是新人！！！

Andyhigh

Andyhigh

顶顶顶！！！

Andyhigh

引物设计软件：methyl primer express   送个premier  6.0吧
8 |* a: j8 N8 t- Y7 V% C  K在线的引物设计http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html与http://www.urogene.org/methprimer/

妖妖空

师兄是做表观遗传学的吧。学校也有老师在做，不过对这方面的内容不是特别了解。好像有些论坛有专门的交流版块。

461650833

引物设计要特意。不然真的不好P。# Q; B' ^; F3 F% f6 c
如果用那个在线软件设计的引物P不出来，可以考虑设计一对外侧引物，用外侧引物P完后的产物做模版，在进行PCR，效果会好很多。8 }2 L8 s% R8 t+ X2 K6 h

Andyhigh

回复 461650833 的帖子
) U. W5 R6 ^$ D
/ [& n" O: L4 L  N1 w& s5 z; u( v自己用的是巢式PCR（用两引物分别P两次）；昨晚测序结果出来了，但是测序样品异常，原因是菌液样品浓度低，未抽出质粒，取消测序。! W% Q1 ]: s5 k/ p

. X. r/ K: e2 H3 _6 N' G! C3 l5 W自己做的 菌液PCR  和      用含氨苄青霉素的培养基挑选的单菌落  应该能说明载体构建成功了，不知道是哪出了问题。
" `% i' [5 x& v- P; B+ f3 B$ E- r1 C& n7 B
今天跟别人请教了下，说可能是质粒丢失，建议我自己提下菌液的质粒（现在已经做好了，正在跑PCR，看能否有自己想要的条带）。  不过自己对菌液的质粒丢失不是很理解，忘高手指点。

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子' i" X  Q+ f# z/ Q" }
$ f" b! T0 b, W$ Q
嗯  将来的工作会围绕表观遗传这一块的，能推荐几个好的论坛的专门交流板块嘛？？？如果你跟你老师熟的话，能顺便帮我问下嘛，谢谢啊！！！

Andyhigh

昨晚测序结果出来了，但是测序样品异常，原因是菌液样品浓度低，未抽出质粒，取消测序。
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先把结果发给大家看看，希望过来人，帮我分析分析问题出在哪了！！！

食毕莫饥

甲基化比率不稳定怎么回事？哪位高手指点一下？