总蛋白的乙酰化和组蛋白的乙酰化怎么检测？

sidalin301

如题，请论坛高手指点一二，最好有具体的方法，不胜感激！

sidalin301

怎么没有人回复啊？还有就是血液细胞的乙酰化能不能检测？怎么检测？

goblinwang

这个不是很多诶，我又一次听我们师姐说道要检测蛋白的磷酸化位点用的方法是质谱分析，估计乙酰化也差不多吧，我也希望有前辈可以解答下，呵呵

chentian820

用ELISA试剂盒检测啊
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PTM2013

细胞总乙酰化水平的快速测定方法 -------免疫亲和色谱-ELISA方法
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) U  w5 k# |0 d/ W- J8 g$ m步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白 $ }, M2 P- v8 D9 G7 @: o7 K& t

5 x' {3 U% N" i/ z$ E2 }( w1.用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm离心2分钟，取上清备用。
2 ?9 h) q& }/ i& T# r" T2.取20-40 μL抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388)， 用PBS洗2次，每次1mL。 ; C7 T( M" b3 w% m* l
3.将细胞裂解上清液与洗好的填料（ICP0388）混匀，39oC旋转摇床低速孵育60分钟。
- U8 N/ x  u. B* R1 ^* _. ^+ l4.1000rpm离心1分钟，去上清，用PBSt重悬沉淀，1000rpm离心1分钟，去上清，重复3次，最后一次用PBS洗，吸弃上清。
' ^/ E, a5 H$ J注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。 7 d2 b) f" r5 H. s
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步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白                                    
' D  O/ f7 O: j1 v  B& s( h5.用20 μL0.1M HCL将步骤2的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2分钟，10000rpm离心1分钟，将上清液体全部转移到含有80 μL的0.2M Na2CO3的ELISA薄板上，39oC孵育30分钟；
) Z& A/ m$ X$ l( ~" c6.取出ELISA薄板，拍干。用PBSt清洗2次，每次均需拍干。加入100 μL含0.5%BSA的PBSt ，39 ℃封闭10分钟。
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5 A/ ~# S. i  G# C+ f步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记物检测蛋白乙酰化水平 # X$ R7 {2 D, _* u$ ]5 C

8 }3 W  o- T0 `  j7.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗2次，拍干。加入100 μL浓度为0.25 μg/mL抗赖氨酸抗体HRP偶联复合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381），39 ℃孵育30分钟。 0 I) O$ M1 [: b. e% {  m* J# F
8.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗板孔3次，每次均需拍干。加入100 μLTMB液，39 ℃孵育显色10-20分钟。最后加入100 μL 0.1 M H2SO4终止反应，在450nm波长下读数。
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