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细胞总乙酰化水平的快速测定方法 -------免疫亲和色谱-ELISA方法 3 c% H& }% m% c0 } P- C3 C
K, ~) D( o" Q0 w, H/ J1 v步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白 3 M& W2 [/ m# f4 R# f
# m. ^) I& V& U( x% `. t8 s1.用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm离心2分钟，取上清备用。
/ A* |9 O5 z9 V; x2 l# ^2.取20-40 μL抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388)， 用PBS洗2次，每次1mL。 0 g7 b. ]; H4 |1 b9 t) z: S
3.将细胞裂解上清液与洗好的填料（ICP0388）混匀，39oC旋转摇床低速孵育60分钟。
& C# S5 l0 r, F) y, M4.1000rpm离心1分钟，去上清，用PBSt重悬沉淀，1000rpm离心1分钟，去上清，重复3次，最后一次用PBS洗，吸弃上清。
: u3 n+ d1 v( \ [; W, Q6 S注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。 Y( |' l8 I' ]! x, `/ Z
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步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白 - N+ P$ v e8 N, K9 D/ F1 C! L
5.用20 μL0.1M HCL将步骤2的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2分钟，10000rpm离心1分钟，将上清液体全部转移到含有80 μL的0.2M Na2CO3的ELISA薄板上，39oC孵育30分钟； / M( m; N, C" Q4 Y5 \9 g
6.取出ELISA薄板，拍干。用PBSt清洗2次，每次均需拍干。加入100 μL含0.5%BSA的PBSt ，39 ℃封闭10分钟。 + }- ]4 i8 @' Y' Y
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! m4 ^ J# J, v4 |+ k3 b9 d0 e步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记物检测蛋白乙酰化水平 - a4 j1 Z% T: d1 f1 J- q
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7.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗2次，拍干。加入100 μL浓度为0.25 μg/mL抗赖氨酸抗体HRP偶联复合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381），39 ℃孵育30分钟。 # {8 w2 }# j+ R M3 B& y- y, j
8.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗板孔3次，每次均需拍干。加入100 μLTMB液，39 ℃孵育显色10-20分钟。最后加入100 μL 0.1 M H2SO4终止反应，在450nm波长下读数。 0 P7 {( H) m0 w& M- Q8 \$ ^3 m& y
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发表于 2012-12-30 10:44
