脐带组织块贴壁法求助

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! f8 i+ k1 `7 y# V: m前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。0 w5 a! v! ]( @2 m
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。! g6 v. a& k+ ~; i6 ?3 b
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        ( f1 D, g3 ~' ~" u3 q4 c
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。. o+ R4 r& i; `- c& u
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。7 A4 U  o% i' e* t9 e% `& E6 l
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
' f/ P" m0 f' Q$ ?! O. w6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。0 E1 e+ x+ G( _4 H
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
1 r( j4 Z* Y1 S; p) y! ~; ^9 S8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
* b. m' ]- T0 X6 F0 s- M9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
. [/ ]8 E! G6 p: k! X+ J# M10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。
7 A$ ^& u0 V0 J11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次

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* r& z4 X9 Z$ T5 [* F2 x9 \前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。3 H" s' t) X0 N
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。6 G' B/ A4 {# _1 M
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        4 \) G( E' S/ f. }! o# m; x
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
: c8 U+ Z! p; K4 ?* L) v4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。; Z( K  G, e- X) R/ E
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。' A+ e4 H% M& x0 W; `
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
- y1 h$ w, o7 a( p( S# }7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
1 e9 x7 G) f% l8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）# l) t4 [, P8 r/ }2 E2 x
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
4 K5 E5 H! _, E10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

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8 D' ]" z3 p7 O# f. _) R前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。; e/ e3 c0 ?9 @
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
) t  k- J% O3 X- b9 H5 e( t2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        $ M2 Z3 J5 q: n: Z) i- @
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
( @2 k1 B9 u" [5 B# G: W4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
, N6 [7 P8 \2 v5 {& h5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
# R6 I" C! w) W' k8 i$ q! [6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
3 Z" Q% A! p3 l- E6 Z7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
/ X& X" W, E) b( G  x8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
! @: C5 A3 o. E9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。1 m+ f+ H7 F* S; E; s
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

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& C! h' }& C) B7 i$ Y: k前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
/ Q+ ~# A0 J3 w+ l% l  U1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
8 F+ J+ Z( ?- X/ ~2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        $ Y  q4 Z7 j/ j
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。" ~& V( ~+ X/ n1 A0 @
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
- X) ~% o2 C9 P0 U) n5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。9 b$ l" U; f, t; y! i7 z
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。  p# h* B! T! Z: ]& H+ Q3 j+ b
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
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9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
$ H1 H" H- Q1 k( a10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。