脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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" j  q0 {1 J1 c: D! i5 i将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。, _( }! \+ S+ D8 e
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。( V; h5 M/ T/ E1 w
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；9 O8 g1 k" [# m
5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。& ~9 ^6 I- F( y
以上是我的组织块贴壁法，请教：' H+ L! h9 ^8 e6 n
①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？: _9 M+ l4 }. m+ z7 t0 W9 I
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
1 G$ b( t% t0 ^$ `* S③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。
5 s. t% d: ~5 [3 Q7 L6 u剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？: a- Q& \5 E. _3 }: y5 s
用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,7 f, z) s/ j- k- Q
以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

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回复 老姜 的帖子4 B9 l! a+ z  u
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3 T9 c/ r9 ~. w! {7 c+ l
这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
4 N; j' A8 J! E* ~- R需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。
, F& j/ H& W+ C# B: \+ x/ |离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 ! j2 F, K. Q) S9 h; R+ }8 s" D
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' J3 Z7 j% u& t/ ^# j
你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿" W5 I8 V4 x! I/ q- i0 j* n( G
先剪成条儿，再剪成小块儿
$ X: P% R9 K3 H! z* \- u' ^* d/ k; V要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起7 t, u: l, d! a! ]; p
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

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1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。
, u, u3 m' ]5 l9 h2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。
( X- I" ]  ]% f3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）
$ D& V, G6 W" n4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。
( U6 a' f9 Z7 ~& o, g7 M供参考，祝好运！

湖南干细胞

回复 ruofan1982 的帖子( z6 v/ x9 {' N' g8 E5 I" C
" Y; z. ]& J7 E; }
需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

* Y( a% c" w" t& p3 F; E/ {# v/ j* C
. ?3 p  C0 C8 k$ V; E回复 dongxin 的帖子3 y( h' \6 J$ F4 B
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谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！