脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

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$ e( N- X$ _& M# i# V! }将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。; P" a) h8 K8 r) a/ h
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。$ e, S( D$ _. L+ Z5 _- U
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；: P, Q$ w5 g3 t& x0 n* }' Z
5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。
; g' ]( y- v3 d7 `/ S( b/ e- [- I以上是我的组织块贴壁法，请教：
) {& n# @# k5 y. m- f7 |/ t( G①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？
8 I  o$ E9 \2 `②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
5 E, t- U2 [) [; i- V③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。  J# r- q5 m& z( b9 I
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
1 \# G% k; Y) ~$ @: H, K6 T用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
  o. e8 B8 ?0 `! q9 D& u1 Q  y/ H以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

老姜

用14好号手术剪沿纵轴剪开脐带，用止血钳夹住血管一撕血管即被剥离。剪碎后（大小不一），用PBS离心洗涤几遍，使上清呈清亮色即可，培养瓶中直接放入组织块（干燥态更利于组织块粘附，无需摆齐，在10cm皿中更好操作），加入少许含15%FBS的培养液，几小时后加足培养液，首次5天半量换液，以后每3天半量换液，15-20天就可收获细胞。

湖南干细胞

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0 o0 c! n; @1 w5 x7 T  ~这是我今天拍的，是不是贴壁太紧密了？好像没看到啥细胞。
- W6 w+ t( X& k* m) d- W! {, V1 y需要倒置贴壁吗？把底面朝上4h再倒转回来，添加培养液。
( v# w5 j$ K) r$ A离心洗涤的时候1000rmp，转速可以不？

ruofan1982

建议用10 cm dish铺剪后的小组织块，剪得尽量碎些，效果是：你用剪刀挑，挑不起。然后加1ML 的培养基将组织铺散开。放入培养箱3-4小时将dish 里的液体吸走，加上新鲜的培养基。隔天半量换液。
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ruofan1982

湖南干细胞 发表于 2013-2-4 11:43 & R  ?# P& [5 a' X! U  ?2 X
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9 t7 d% d* {: h* t, _+ E+ i9 W; h: N你这个剪得不是很碎啊，还需要多剪剪。

小冬子

同意楼上，建议用10cm的培养皿
+ N7 J  A% m0 o# O9 J4 ?6 }先剪成条儿，再剪成小块儿: A# E, f" X: h; s# R) W
要留空隙，不然爬出的细胞会重叠在一起# v" ?+ |( o( B
直接放在盛有PBS液的培养皿里剪就行，剪完贴到新皿里，放培养箱一会，再慢慢的加入培养液，少量

dongxin

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1. 组织块的大小并没有很严格的要求，个人觉得3-5mm3都没问题，太小很难剪，并且在加培养基时也很容易漂起来，不贴壁就不会有细胞呀。  w5 m3 b* z: o5 f% s2 G; [5 W$ U
2. 组织块要有间距，不然细胞爬出后没有空间增殖，个人觉得1cm的距离就可以。$ B* K/ ]' u5 q0 V6 D) Z! _! t
3. 颜色发黄可能是标本本身的问题吧，还有就是操作时间太长也会增加污染的几率（时间过长，操作者容易疲劳，会增加污染几率）: B1 \( I9 J6 y
4. 建议最好用10cm的皿，方便将组织块种好。并且直接种块，不需要用培养基润吧。$ b9 \3 L; S6 L8 d' X$ d. K+ b
供参考，祝好运！

湖南干细胞

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需要倒置贴壁吗？

湖南干细胞

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* a1 M: v$ \* K2 T谢谢，你的组织块剪完后要不要进行离心洗涤或者PBS清洗？以前的帖子都说要倒置贴壁吗，你培养倒置贴壁不？

老姜

我将我的操作方法已描述于你，只是我是接种在10cm皿中，洗涤后的组织块如果有50ml离心管半管子，我可接种到10cm皿×6个，不可种的太多，也不能太少。3-5天后镜下可见组织块周围有大量小圆细胞，7-9天可见单个散在梭形细胞，该细胞出现则很快能增殖了，长势很好！换液时间也告诉你了，液体发黄也正常，按点换液即可，细胞能耐酸。祝你好运！