脐带组织块贴壁法求助

漂泊的风

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不需要的，直接底部贴壁即可，很容易爬出来的细胞，一般5天即可看到细胞

漂泊的风

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' r3 M0 f4 S9 Q# H一般不需要的，除非脐血残留比较多，整个组织块是红色的，这时需要用PBS洗涤一次，否则不需要

湖南干细胞

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& M0 p' v/ Z9 I+ c6 y+ q哦，谢谢。

spring1221

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. O, e9 O; J- T, B4 Y第一次加液一定要从侧面贴壁慢慢加然后平放，不要直接冲过去。组织块铺的时候的湿度也确实需要注意，加油

湖南干细胞

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" p. Y9 j& d- S0 {3 e; t好的，谢谢。

单个核细胞

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. U) u% k, _) {5 E
4 m) e/ E# {" z. O8 C6 ~- P% [传代用0.25%胰酶即可，T75瓶培养，1:3传代，也可以根据需要接种相应的细胞数，比如2×10^4 cells/cm^2，1×10^5 cells/ml 等等。

2013sp

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2 }+ v1 T- c" n; b. g3 @: Z9 V  _0 P: D1 Y1 u8 j7 j4 n: |7 U4 U
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
& m- p5 N4 Z& O1 r2 d/ B1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。0 B: W$ i0 ^7 a7 \( O
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
' a* N# z5 u  t9 \8 X: C6 e! _3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。. [8 S" y2 W6 j7 }& j; n
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
$ @, N3 m( |/ K9 i3 R' P2 E5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。, N1 @3 f. [$ L0 [- t. \: `, M
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
8 I1 w- M/ S( q! `! {7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。" J4 x/ V5 _2 _* A, O' [& K3 L$ [
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
( F9 M5 f- l' i  p. @( K4 u9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。" S" K4 k/ h7 d6 W9 ^
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。* E' k* X+ x: A3 g  X" O+ {
11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次

2013sp

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* R* s7 b, V, H3 @' R# v8 y0 t6 R5 U
7 _3 _' A' c; K前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。% {$ \  i6 I7 \: x2 o! D: @
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
( Z: b4 r& L* ]% G; V* K2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
. K$ j$ c5 q; }, E6 L/ e3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
; j  V9 K$ A- L% w0 C+ k3 ~/ L4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。9 i# j; ~; b1 v2 f/ Y) y2 C
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
8 F, w7 p" {% W  X1 d2 G! C6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。' V0 C  n5 H8 c# I8 Z
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。! R7 R9 t/ g  A" [. Y
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
+ `' i) M/ t+ h5 x2 c9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。' f# M, g* b. E4 Y
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。8 \1 \( ^' J  g# [. z7 f
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。. Y5 M( x; G' p0 @
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
% }" F' f0 X- r9 z3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
  C7 `9 f7 G% [* V! D4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
5 |4 B$ D5 \; H6 _+ _% E& r5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。1 W6 r0 i5 e% a8 n% ?9 D( [
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
& e' d" t$ O& k+ \3 [: s7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
$ h$ F; p% R4 T8 \3 K$ e8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
+ `' {  l: m* r0 o* s- x9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
  s5 P% n+ w! V: g7 s8 k9 C10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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9 k; |. V4 ], ~前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
$ e5 T3 a" v) z. l8 `1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。/ q8 }4 k8 v2 H! |+ F) c; E# M
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
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4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
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6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
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8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
; ^; g/ ^) Y$ y+ \9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
$ H0 V/ ^3 K- w5 H7 g. C9 r10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。