脐带组织块贴壁法求助

漂泊的风

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& f# f5 ^8 O( H& N: Z
* g9 T+ w+ l/ z8 O不需要的，直接底部贴壁即可，很容易爬出来的细胞，一般5天即可看到细胞

漂泊的风

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; b1 ]/ u+ F3 D' L3 j7 w+ O3 }! }5 n一般不需要的，除非脐血残留比较多，整个组织块是红色的，这时需要用PBS洗涤一次，否则不需要

湖南干细胞

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& j" j* T+ {6 e6 C& }3 M4 b- b2 `8 G8 Q1 s
哦，谢谢。

spring1221

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( F( Y8 U" A9 V0 U
第一次加液一定要从侧面贴壁慢慢加然后平放，不要直接冲过去。组织块铺的时候的湿度也确实需要注意，加油

湖南干细胞

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. V: i. L. I3 h! e/ l* V/ b, H好的，谢谢。

单个核细胞

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( e" G. }; O9 D7 U$ M) Q) P* |1 G7 w5 g
传代用0.25%胰酶即可，T75瓶培养，1:3传代，也可以根据需要接种相应的细胞数，比如2×10^4 cells/cm^2，1×10^5 cells/ml 等等。

2013sp

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  @. |, t' i+ p  T5 k
0 J- a2 |/ J# t/ ^# ?, j+ n前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
9 L* v. O9 D2 n- @( ?1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
: F5 ^: V$ h( j1 m9 N8 N' b/ n2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        ! _; ^0 o0 e2 t  {: N" E
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
$ b( n% u2 x! \! \1 M6 E  ~; c0 A4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。/ F( P7 |! Q/ D4 y4 L" G
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。; K4 m" K; \0 C9 w% `' x5 J5 H. U
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。. z) S* u4 J) c6 E. [0 W
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
) U& S+ I2 `9 L5 A8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
2 j$ a% I( A' K9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。! F: S" x3 j' O7 |8 s
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。
4 b0 h! r, L$ m' c/ d+ U4 H11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次

2013sp

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$ ^! @. v1 N3 l% A' d
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。# b9 Z' }) p1 F
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
6 j7 }$ }( `. n& E. n2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
) P$ d0 w* q5 s4 {; z3 Q2 o3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。( N3 B( N# R' u' N2 E. h
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。; J2 Y& f% R, Z! x" w+ g
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。0 C5 j3 D& R# H' s
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。% v% j" t4 v+ Q$ `, q* H
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。! M" H7 q# o8 Y0 q( W  {6 t
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）$ v1 L; c! U7 U2 s7 R; F6 V5 w8 C
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
- E: U9 G" @7 s* X10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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- x* q1 I. \% ]2 A前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
3 E( [- W* _- t1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。: ~# I3 o& G' A# R5 Q6 b6 F; g6 j% X
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        , P% F  r, i! q" J/ \- H: C
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。$ ]" u7 }7 I: m6 y! k. l
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。. i( h. Z5 n5 L+ v  Y# ?3 e( W
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。- x) @3 i% @$ R% x& l& |( C6 I
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
2 s$ o# r5 [8 F0 X' d7 `& T" P6 S; \7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。, s* R( }7 W* w5 r0 q( ]- w4 v4 @" C
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
! Z3 c7 S7 @9 ^( _' P3 Y& |9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
. X& U' d9 |+ n* i10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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7 E+ `) ^# N6 @3 ]+ X: p. B9 W前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
% v' u4 P. u7 e5 _3 ^* b1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。9 W8 j% ?9 s9 F2 i
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
1 F  s) ^& X2 s+ _. Y$ ^4 c3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
/ q) w; S  e$ V+ h4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
- D. M" e! }2 y+ \" W5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
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7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。5 {. X& V& u, l0 }6 L0 k9 d
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）& v9 f* p3 X! B4 u' x' i1 b
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。, H0 N% Q+ ]; }8 E& E
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。