脐带组织块贴壁法求助

老姜

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; ^) {- z6 X# P- o/ J/ p/ H你不妨将组织块用PBS洗涤后，直接加在新的干皿上（实质组织块还是湿润的），量要少于你第一张照片上的量，放入培养箱中3h后，轻轻加入8ml生长液，直接放入培养箱内，4-5天半量换液（这期间不要拿出来看呀，找相呀，太折腾了，它没法贴安身)以后三天半量换液，直到12或15天后，再根据细胞生长状况决定是否吸弃组织块。

湖南干细胞

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谢谢。1）脐带在半小时内开始操作，PBS冲洗3次后，剥离动静脉，撕出白色胶块（时间1-2小时）；2）剪碎（0.5-1小时）成0.5-3mm小块，倒入离心管，PBS 1000rmp，5min洗涤1次，添加1ml 培养液，组织块倒入到FBS包被的培养瓶中，9小时后添加培养液至没过组织块，此时已经有细胞爬出，并且很多组织块都漂浮 ，1天后大量细胞爬出，3天后半量换液，换液后细胞仍在，第5天细胞就基本上消失了，只有完全漂浮组织块及细胞碎片。没有每天动培养瓶，组织块就是贴壁不紧。

湖南干细胞

组织块贴壁法培养皿要铺多聚不？用玻璃的还是塑料的？
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湖南干细胞

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谢谢，换液前不敢动了。但是第一次组织块添加液体前就飘了好多。

spring1221

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第一次加液有组织块飘起来是正常的，建议加液时间再延后一点，倒置24小时后加液，贴壁时间太短，加液后就很容易让组织块浮动。组织贴壁法筛选的间充质细胞纯度比较高，也比较容易操作，有些文献报到动静脉跟表皮清除不干净都可以长出来，所以关键还是培养液的选择跟操作熟练度。祝你早日成功

老姜

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6 X% s/ B/ I3 u4 V' |3 ^# [# Q
你用低面积多大的培养瓶养细胞，Ｔ２５总量只能加５ｍｌ液体，Ｔ７５加９ｍｌ还行，平底若铺了血清应该将血清晾干放组织块不漂的可能性才大，液体加多了，浮力大自然漂。培养瓶培养挑出组织块是不易操作的。培养细胞血清的浓度不是愈多愈好，最终不超过２０％为佳，因为体内废物的清除通过血液，血清中的含量也不能忽视。物极必反！

单个核细胞

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几条建议：
6 z' l. |# K1 l* V$ A1.华通胶剪碎后不要洗涤，直接接种组织至培养瓶/皿。0 _; E6 a/ Y+ ?. h9 x2 X; ^
2.若是采用进口（康宁等）培养瓶/皿，不需要FBS包被。  O( o, z: g4 a1 R3 z
3.贴壁3~5小时后补加培养液(下午接种的可以第二天加液，即贴壁过夜)，加液后的培养瓶/皿就不要经常动它了。
4 c: d- @3 t7 }" W: ^4.第二天观察是否污染，8~10天后观察是否有细胞爬出。
/ y4 J: s5 O8 c9 S% g! q5.细胞爬出后，可去掉旧培养液和组织块，换新培养液。
9 z% ^4 U7 ~5 b+ X6.待贴壁细胞局部生长致密时，常规方法传代。

湖南干细胞

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谢谢，我确实发现以前没有洗涤的组织块贴壁牢些，我有一次细胞传代了，结果传代后细胞就一蹶不振了了，你也用0.25%的胰酶消化传代吗？我也看很多人用0.05%或0.125%胰酶消化，1:2传代？

湖南干细胞

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谢谢指点。

湖南干细胞

总结了一下各位前辈的回复，我想可能贴壁不牢主要在于，组织块刚接种时，组织块太湿；第一次添加液体时液体时枪头的冲力比较大，细胞容易在添加培养液时被冲下来。所以，打算改进这两点。