经验教训：belta巯基乙醇失效导致western半年内的结果失败

临床干细胞

之前我们医院实验室里western始终出不了结果，蛋白带非常乱，背景一片混乱，做细胞时还好一点，跑组织榈根本是乱七八糟，当时找原因，几乎把western的每一步都进行了排查，可结果一直不理想
0 E" ?2 a9 B5 R) Z
4 _8 u- x! X  w( V, x/ x后来，无意中我用相同的样本，在别家医院实验室做，结果很好，于是，就怀疑到了loading buffer中的belta 巯基乙醇上面，原来，我这个实验室的一个博后，半年前一次性的配了一大瓶的loading buffer，其中加了belta巯基乙醇，一般来说，loading buffer都是室温保存的，所以他们也没有放入到冰箱里，但其实，belta 巯基乙醇有很大挥发性，应当现用现配，就算是室温保存，也不应当超过30天，超过30天后应当再补充，这位博后配了这一大瓶loading buffer之后立即就加了belta 巯基乙醇，但很长时间没人用，当实验室里人开始做western blotting的时候，又没有及时补充belta 巯基乙醇，也没有加DTT等其它还原剂，而且loading buffer每次用量很少，这一大瓶所有人都在用，但没人想到此时的belta 巯基乙醇已经挥发的差不多了，所以几乎没人能跑出很好的带来4 S" N, a/ A& _* `

1 q8 L0 D; J* V! H6 G) K我重新配了新的loading buffer之后，大家这一段时间以来结果都不错，经过这件事情，深刻感受到了实验真是差一点都不行啊，一个小环节出现问题，就可能导致整个实验失败9 J, l5 b2 ?3 l

/ h" z. _6 X1 h+ a0 n" u我现在加了belta 巯基乙醇的loading buffer，都保存到－20，这样保存时间应当会延长很久了
9 ^4 y! v; I! o5 G5 o1 K2 u( y1 @: S. ^/ R; ?

weiyepan

回复 临床干细胞 的帖子# }. i' }. v; g/ r% e+ Z5 a

5 i0 R" x/ x4 e+ d# W+ q其实只要密封得好，放室温也没问题的。我自己配的就是配好5xloading buffer w/o reducing reagent。一次拿1mL出来加还原剂，用个3个月没啥问题。放低温SDS会释出，每次都要加温很麻烦，感觉反而会加速还原剂的降解。
5 W( c0 A4 V2 U, L2 j另外beta-ME这东西见光分解，要放暗格是真的。

86964109

回复 临床干细胞 的帖子
7 @+ I8 }9 N# Q4 V: f$ |
' H% v' z2 n. Q2 I+ X/ F# d! Q我们实验室都是配好后分装，放在-20的

newjack920

嗯 还是配制好进行分装，-20保存为好，用时提前室温融解

微笑流滢

回复 newjack920 的帖子3 }% c3 @" ^) G7 X8 E

. @# S$ X" d! M7 e3 p) v不用煮一下吗？觉得直接加的话还是有点粘稠！