经验教训：belta巯基乙醇失效导致western半年内的结果失败

临床干细胞

之前我们医院实验室里western始终出不了结果，蛋白带非常乱，背景一片混乱，做细胞时还好一点，跑组织榈根本是乱七八糟，当时找原因，几乎把western的每一步都进行了排查，可结果一直不理想: i; [' f* R) q: U/ U7 A

8 z* p' s6 T9 D+ y) F  B后来，无意中我用相同的样本，在别家医院实验室做，结果很好，于是，就怀疑到了loading buffer中的belta 巯基乙醇上面，原来，我这个实验室的一个博后，半年前一次性的配了一大瓶的loading buffer，其中加了belta巯基乙醇，一般来说，loading buffer都是室温保存的，所以他们也没有放入到冰箱里，但其实，belta 巯基乙醇有很大挥发性，应当现用现配，就算是室温保存，也不应当超过30天，超过30天后应当再补充，这位博后配了这一大瓶loading buffer之后立即就加了belta 巯基乙醇，但很长时间没人用，当实验室里人开始做western blotting的时候，又没有及时补充belta 巯基乙醇，也没有加DTT等其它还原剂，而且loading buffer每次用量很少，这一大瓶所有人都在用，但没人想到此时的belta 巯基乙醇已经挥发的差不多了，所以几乎没人能跑出很好的带来
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我重新配了新的loading buffer之后，大家这一段时间以来结果都不错，经过这件事情，深刻感受到了实验真是差一点都不行啊，一个小环节出现问题，就可能导致整个实验失败
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% d: k7 d8 g+ B- W+ H  L0 f我现在加了belta 巯基乙醇的loading buffer，都保存到－20，这样保存时间应当会延长很久了
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weiyepan

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/ Q: c" {( ]0 s' Z
9 V# U% f# X/ L/ o. {  T& {% ]其实只要密封得好，放室温也没问题的。我自己配的就是配好5xloading buffer w/o reducing reagent。一次拿1mL出来加还原剂，用个3个月没啥问题。放低温SDS会释出，每次都要加温很麻烦，感觉反而会加速还原剂的降解。# w# m0 k! l& U, X! e  _9 ?
另外beta-ME这东西见光分解，要放暗格是真的。

86964109

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/ e: L  `% l( k( F. f# L! z
1 A" v# h. P. _, ]1 b+ f( g2 L- _) w我们实验室都是配好后分装，放在-20的

newjack920

嗯 还是配制好进行分装，-20保存为好，用时提前室温融解

微笑流滢

回复 newjack920 的帖子, R0 s# d: L$ e
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不用煮一下吗？觉得直接加的话还是有点粘稠！