急求:关于流式细胞仪对细胞表面抗原鉴定的问题

李兰兰

请教大家一下，我的染色步奏有没有问题？
( \/ l; o8 l* e0 L6 h1、第一代大鼠骨髓间充质干细胞80%融合时，胰酶消化，含10%血清培养液进行终止，1000转，6min离心一次，然后加入ph7.4的PBS洗涤一次，加入0.5ml的PBS重悬细胞。
4 w* R2 f. _# L7 c2、加1微升的一抗CD34、CD45、CD90、CD105，冰上放置30min。
* ]! B3 R# Y0 ~" f, S3、加PBS洗涤2次，以0.5mlPBS重悬细胞，加入相应二抗1微升，湿冰避光放置30min。- t: O( P* M6 z% b- H
4、加PBS洗涤3次，以0.5mlPBS重悬细胞，上机。0 o7 |3 k6 i6 m: e* `

, |" q' |" S& l( G" ?* Z' k结果四种抗体及阴性对照的图基本上一样，结合率非常低，0.7%左右。
7 q: Q( t* \  T  u" y7 {9 j/ \; |2 h请问各位应该是什么步奏有问题，应怎样改进。急求各位指点

李兰兰

一抗CD45、CD90是abcam公司的，CD34是santa cruz 公司，CD105是millipore公司的，二抗是FITC及PE标记的，是北京奥博森生物技术有限公司的
2 C4 t& n; x4 N4 h6 U

李兰兰

回复 飞翔的十字架 的帖子
0 m' I" G4 \: Y5 f4 o; j# M4 S1 u% d" @& [
你们孵育是室温么？  一抗i和二抗一般加多少量

李兰兰

回复 evial 的帖子) ]- v  F: u  ]5 R* `( C7 I
& A4 i* O" X. o
便宜一些0 J( }( R& S8 P

李兰兰

回复 以诚相待 的帖子
$ o# Q& H/ \% e3 ~
4 J2 E0 P5 p) D# p我是单标的，希望下周做，可以顺利。