急求:关于流式细胞仪对细胞表面抗原鉴定的问题

李兰兰

请教大家一下，我的染色步奏有没有问题？- ^0 M% r0 _' c1 ]& }
1、第一代大鼠骨髓间充质干细胞80%融合时，胰酶消化，含10%血清培养液进行终止，1000转，6min离心一次，然后加入ph7.4的PBS洗涤一次，加入0.5ml的PBS重悬细胞。
  `( t) I/ X/ D* I! ?  U" Y2、加1微升的一抗CD34、CD45、CD90、CD105，冰上放置30min。
8 }6 t) W1 W8 x3、加PBS洗涤2次，以0.5mlPBS重悬细胞，加入相应二抗1微升，湿冰避光放置30min。
& o- V+ }& p7 u7 A" w9 r8 f4、加PBS洗涤3次，以0.5mlPBS重悬细胞，上机。
& X% X5 _1 S& M8 p/ R4 y7 _' S5 k) U* C% u8 W( J
结果四种抗体及阴性对照的图基本上一样，结合率非常低，0.7%左右。7 q# l* @) v+ M; _3 O; H
请问各位应该是什么步奏有问题，应怎样改进。急求各位指点

李兰兰

一抗CD45、CD90是abcam公司的，CD34是santa cruz 公司，CD105是millipore公司的，二抗是FITC及PE标记的，是北京奥博森生物技术有限公司的7 d3 z9 ~9 u1 S8 I/ N

李兰兰

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  r) N% Q, `0 I; i$ Q4 E2 }! B+ `5 A
你们孵育是室温么？  一抗i和二抗一般加多少量

李兰兰

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& N' Z9 B/ ^" J1 R  V3 e
便宜一些- j. I2 m! R0 c/ t2 o' Z/ n

李兰兰

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我是单标的，希望下周做，可以顺利。