免疫荧光二抗用什么稀释？

请叫我晓白

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, E* S  [' A5 A% z

3 g# ~4 j# D7 R2 N老师，我又做了一次，请你帮我看看这张图是细胞吗

xiaoyurly

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没问题，祝好运

请叫我晓白

xiaoyurly 发表于 2013-4-17 15:45 * s$ @) y. _. E! X4 H
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6 k" Q' ^4 w8 H. K# B& ?& V( G/ S  g7 Q! g1 L+ N" q6 }
染冰冻的确实少，但是抗体说明书上明确表示可以用于冰冻切片染色，我们染不出来才 ...

" S, X, ]6 X. E5 Q0 i* S& M+ `
是的，是染梗死后固有的c-kit心肌干细胞，没有注射细胞，所以找不出来，根本达不到文献上那种效果。
* J# W, B$ g1 M, ^* Z- _7 _真是郁闷。准备再做几次试试。有新问题的话还请您多多指教啊

xiaoyurly

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: v. H0 ?: Y$ Q' K/ n
: ?- C& l1 c( Q2 }8 i! B& E/ z染冰冻的确实少，但是抗体说明书上明确表示可以用于冰冻切片染色，我们染不出来才换成石蜡，成功率才高了的。- T# j% J! b- ]8 V
我们做的是心脏切片染色，心梗后5天的组织切片，还在炎症反应期间，所以c-kit阳性细胞较多，常规荧光显微镜拍摄。现在用共聚焦的挺多，照片清晰度更高。如果是正常心脏固有的c-kit阳性细胞应该是比较少，你是想染心肌干细胞吗？可能需要大量切片染色，然后耐心找视野
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细胞海洋

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8 a/ ^+ N. ]0 N# q( `* M! r! v& c0 o2 }5 e
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请叫我晓白

xiaoyurly 发表于 2013-3-18 09:50
) u$ l8 Q( I. z1 A8 H回复 请叫我晓白 的帖子, `8 }+ p# X5 p  m, n* x+ N+ I4 P

5 d/ {' _8 z+ f& }8 E. Gc-kit染色确实不必破膜的，我们以前也做过大鼠冰冻切片但是效果不尽如人意，后来用 ...

1 C6 u( Y1 D! u9 U老师，我最近做了几次都没有结果您图片上的结果。哎 郁闷。我想请问您当初做冰冻也没做出来会不会是因为c-kit这个抗原不适合做冰冻切片？需要做石蜡切片才行？我想可能有几个原因：1.c-kit+细胞很少没有切到或找到2.一二抗浓度不合适3c-kit这个抗原不适合做冰冻切片1 j( P  o( `9 K$ Y3 s1 @% K- J
就您的了解c-kit是否可以做冰冻切片呢？我看了许多国外文献他们的染c-kit的方法都是免疫组化用石蜡切片（具体方法太简略了），但是结果的图却是共聚焦的图。期待您的解答。还有您做的是骨髓的c-kit细胞吗？我做心脏固有的c-kit细胞

细胞海洋

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) x2 H( j+ ^% ~9 {
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nevermore

用BAS稀释抗体和用PBS稀释 原理上有什么不同？我试过用PBS稀释，信号强度很弱。另外，抗体浓度过高会使结果强度降低么？为了提高荧光强度，我特意提高了点工作浓度，可效果还是不好，其他步骤都是按照标准protocol

请叫我晓白

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4 q$ p7 m- i8 C9 Y$ H8 d多谢多谢

xiaoyurly

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  d& v+ N4 {: C5 p! Q
" Z2 \& B  j7 I# }- j& X  o石蜡切片常规脱蜡复水，柠檬酸缓冲液热修复，88-96℃ 15-20min，冷却1h后PBS洗一次，羊血清（原液以1:20比例用PBS稀释）封闭室温30min，一抗1:100溶于含羊血清1%的PBS中，4℃过夜；转天取出复温1h左右，PBS洗5min×4次，对应荧光二抗孵育，4℃ 4h or室温1h，PBS洗4次，封片镜检