求助人羊膜间充干细胞分离方法！！！！我的细胞不生长求助！！

congxiaoran

我采用的是先30min胰蛋白酶消化上皮细胞，再用0.75mg/ml 的I型胶原酶消化间充质干细胞30min，所得的细胞3d换液后不生长，求原因？希望各位大侠提供更好的方法，不吝赐教！！！

coffee.cat105

不用消化上皮，第二天换液，把不贴壁的洗洗倒了就好了，间充质的生长速度，上皮是拍马都赶不上的，你要实在不放心，P1的做个单克隆也可以，你这个方法白白伤了细胞，其实意义不大

congxiaoran

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5 g, |. l3 P9 w) Z! b: V5 e
4 s! L$ p/ L: s. @1 f5 |您的意思是直接用胶原酶消化吗？能说的详细点吗？谢谢

coffee.cat105

没有什么需要详细的了啊，就是剪碎，胶原酶消化，具体消化时间要看你的酶，你的组织，30MIN其实差不多了，消化完2500G离心，离心完加上培养基养，第二天把上清倒掉，换液，基本上就可以看到贴壁的细胞了，增殖很快的，传个一两代就很纯了，如果不放心，做个有限稀释，间充质没什么细胞密度要求，一个也能很好的长起来。

congxiaoran

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. Y+ E* w* t4 {- h. p/ ?  {3 m6 m8 H; @: ^$ G- J5 ]
好的 谢谢

ruofan1982

1.整块羊膜先0.05%胰酶消化30分钟，然后中和，PBS洗3-4次，尽可能去除上皮细胞。
& S0 T7 @  |/ Y% ?' t2.剩余的羊膜用1mg/ml胶原酶I消化1小时，洗涤离心，收集细胞。此时得到的细胞多数为间充质细胞。
; b; h+ {) j! @0 [4 N' E6 A3.羊膜上皮细胞生长速度很慢，且状态不好。传代一两次就可以纯化间充质细胞了。

硕果累累_555

回复 congxiaoran 的帖子; Q" [1 q3 J6 }* ]/ Q

  U7 B" m* ?- p3 ^* t4 w; h先用胰酶再用二型胶原酶消化，消化的一定要彻底些，否则细胞不容易爬出来。通常第二天细胞就能游离出来，3-5天即可传代。

congxiaoran

回复 ruofan1982 的帖子) R- K& v8 l$ H6 C' U1 b' B* D

+ E: F- O8 x4 d# B1 H" ?非常感谢！！！！

congxiaoran

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% r1 _( d! |( c) R' i' y; R
$ K# ?; @: T4 A' @2 ^请教下 您的意思是用胶原酶消化过夜吗？

硕果累累_555

回复 congxiaoran 的帖子! o6 J  H7 k7 s% C9 d) Z' \) ~  L
, U; [6 |% I, b$ ~  \( F7 T6 C* y" O
不是 如果直接用胶原酶消化可以过夜试试，如果先用胰酶再用胶原酶，可以将胶原酶消化时间适当延长，具体延长时间要你观察组织消化的程度决定。