求助：成脂诱导MSCs油红O染色问题

light_blue

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成脂诱导8天的MSCs做油红O染色鉴定，结果有很多红色的杂质，细胞里面的脂滴好像没有染上，请大家分析下出问题的原因。9 |% N; i3 n; S7 c$ \
油红O配制方法：# P) y7 U( ^1 V8 f4 G
0.5g oil red o溶于100ml异丙醇中，使用时，油红O：蒸馏水=3:2稀释9 w2 G5 l+ a% ^* @  E) u4 F
染色步骤：  g8 N4 [% r% ]/ `4 V& {( \
1.弃液，95%酒精固定30分钟
6 R+ C& \+ M( K$ l/ s2 w2.吸弃固定液，PBS漂洗1次
9 S* A* K; B4 ?5 I3 U; ~7 N3.油红O使用液染色40分钟) {; T. O% i3 c  [
4.PBS漂洗3次，拍照。( }# D4 L* n4 p% p8 p
下面是油红O染色的图与对照组未成脂诱导的油红O染色的图，里面红色的杂质很少/ x4 @* U& G* ^1 D
感觉诱导是成功的，问题好像出在染色方法上。

light_blue

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light_blue

不会传照片，不知道能看到不。

漂泊的风

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( b4 l4 ]! _* j" V- l( r! b  |8 J6 ^. n, _: ]- H  o; Z
照片时能看到，但是看照片你是没有诱导成功，成脂应该是很明显的脂滴，很明显的- w  x% w2 B8 h- W3 `

tjbone

固定的时间太长！一般最好用75%的酒精，太高浓度长时间会将脂滴溶解。( G' P% s  P; [4 K) y
另外，染色要随时显微镜下观察，效果好时即刻停止！！！

kyo000

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- M9 C1 I. U  i' `/ [4 ?! y9 ?
- b! v  f  x4 N' r4 @% }9 T油红O稀释后不知道有没有用滤纸过滤再用，还有我们用的固定液是4%甲醛。

light_blue

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1 ]$ o+ i: I9 p: G6 X# T: J
我看诱导试剂盒的说明上的图片也有很明显的脂滴，这次第一回做，不过我光镜下看，诱导组已经有很多圆形的小亮点了，对照组没有，认为是脂滴才染色的，结果染色的时候小亮点都没染上。

light_blue

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% U/ ?6 }7 V7 Y) w
9 m/ Z" `0 n( u/ Z$ ?4 m我看有个帖子上说95%酒精固定，就用了，另外固定的时候，感觉刚加完酒精一层细胞就下来了，很多好像都裂解了，下回准备用甲醛固定，不知道能行不。

light_blue

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( z  ~% s+ j& ^, T$ X/ {& J
! o& Z3 V: X7 ]) N8 v$ _  S* l我用的纱布过滤，好想效果不太好，加进去染色液，肉眼就看到很多杂质，下回准备用针头滤器过滤不知道好不好用。

supercell

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7 O% c7 u! |5 A8 t$ U2 z% v1、10%中性甲醛的配制 3 x. T, t. L2 C" C2 S% o
材料：中性甲醛(多聚甲醛) 密封瓶
: I8 @* M& c4 ~8 o: U
* V) M! b$ {) k% T5 A. z7 P' ?称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的三蒸水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。
  O# X  ?9 t. h) \ ( ]: ~6 {# P/ Y( h- d, f
& }6 I2 p" g# _
2、染色液的配制
6 Z8 D% D$ [5 y3 d9 F9 S1 P
# b& h) p, ?1 Y9 L材料：油红染料 棕色可密封瓶 异丙醇 研钵 漏斗 定性滤纸
- ~1 C; b+ y2 ]3 T) V" Q' w, c6 \" S& D+ E* o: b; @
称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4℃保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。
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* w4 N' H1 X* j' @3、培养载体 3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品，hoechst33342染核的话，塑料板自发荧光也为蓝色，必须考虑。5 j3 o) s1 c9 Y4 v4 W# S7 o

7 q$ Q! z/ |* j9 V- k. I6 u4、.染色对象 间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。
  r/ u8 `# m9 b8 [; P7 p+ C" ~# {0 }4 A# C/ O& ^
5、注意事项：2 a" n! r! C' m* a. y# C

% k: T+ z: g- i  t脂肪油红染色，有的是动物/人体脂肪组织切片，或细胞爬片。各有操作差异。以下是各论坛方法小结，不全。
7 f2 M7 M, X# k' f2 a* @8 q4 a/ @" ~& o' l4 z
(1).完全成熟饱满的脂肪细胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以压片，切片都要考虑到这个问题。 % K- b* d6 }0 U7 I8 L2 q
% v: W( Q8 E, p- q( s8 G5 o
(2).细胞爬片细胞溶液脱落，特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。
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  x- `. p( g( j7 |(3).如果做脂肪组织冰冻切片，冰冻温度比普通要低，切片厚度加厚。) m( `( w2 w: Q1 U) m' S
7 U3 Z0 {5 ^' h2 _* y1 [
6、染色步骤：
* D- u6 a( x& v; p3 h$ X3 V# [5 V) U  {+ m8 g
(1) 先小心轻缓倒去培养夜。
" |$ h* c' I& l3 p
1 C2 W0 n3 C* {3 {(2) 用pbs轻缓漂洗(不洗没问题)。. I, S; D: v2 l; }$ D7 d* ^. w
1 h1 A! W2 x* G" p- t
(3)加10%中性甲醛固定30min(实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可)。固定的是细胞膜。
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8 q" T/ K. v5 T1 G; v. r(4) 稀释油红储存液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10min(除去一些杂质，染色结果更清晰)。 4 M, ]. o  |$ ~
(5)染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml(实际染色时间1小时都可以)。
8 N6 O) n+ |6 r7 a6 f
! T4 Q# V' E9 P# G(6)脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料(实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少)。
4 e" a1 F. o& R6 e& s/ `) k- Q/ {(7) 复染，淡苏木染色1/5分钟，pbs漂洗(这一步不做也可，看试验需要，并且苏木素会把胞浆染红，如要显示核， hoechst33342也可以，浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上)。 6 d$ V" q+ {0 k3 m9 f! Q# R
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(8)甘油明胶封片(封片后可长期保存)。
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(9)显微镜观察。 8 D4 S* S, Z$ C0 m7 H" Y$ O
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