小鼠骨髓密度梯度离心 FCM结果

dyg108

为得到小鼠骨髓单个核细胞，选用ficoll 1.077密度梯度离心。小鼠骨髓细胞以PBS（4 ml）悬浮，ficoll 4 ml，400 g，20 min离心。结束后白膜层明显，PBS悬浮细胞4 ℃过夜后染DAPI，FCM分析，结果如图：+ `: [' o: F& `) q; k

2013-5-9 13:10 上传

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) P( h/ V1 P4 K/ F6 \3 L# L5 Y请教，第一张图红色部分是什么细胞？为什么没染上色？  h- v! h% ?9 C% x
又取来ficoll底部的细胞，DAPI染色，FCM结果如图
8 I  q+ A+ d" g% s4 O3 p

2013-5-9 13:14 上传

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. u* l) }2 f* N2 D2 u这个更是困惑了，请教大虾们

lyj-0017

回复 dyg108 的帖子
, j' B  }8 L# |; S0 R! c. w
# m% Z+ O0 B( U/ r% i/ l8 r/ E) C      小鼠单个核细胞的分离常用密度为1.092的小鼠淋巴细胞分离液进行分离，而分离人单个核细胞常用密度为1.077的人淋巴细胞分离液。我认为是你用的淋巴细胞分离液的问题，分离液密度不适应，所以分离出的细胞分层也不同。# p  |9 Q. l! x7 y9 l" [0 B) i& z( ^
    另外，你小鼠骨髓细胞悬液与ficoll的体积比是1:1，而常用的外周血或者骨髓细胞悬液与ficoll的比例是2:1，也许这也是一个导致细胞分层不正确的一个因素。

dyg108

回复 katysong 的帖子% ^2 |( r7 Z  [! S  \3 i6 N7 O

! r- |1 q* m' W1 G, D, A非常感谢，DAPI电压是以没有DAPI染色的细胞调的。. ?5 n* A2 q! t: F3 r1 n

katysong

1. 其实DAPI不是一种严格的区分活死细胞的染料，如果DAPI足量的话，活细胞核也会着色，表现为弱阳性；若是要区分活死细胞，建议可以试一下7-AAD。) O/ M- q# r3 V& \  D- C+ l
2. 这次实验DAPI的电压是怎么调整的，怎样确定的阳性和阴性，有没有绝对阴性？( L. @( z, l) e9 ~+ u* j' s
3. 002中第一张图，红色部分细胞那么大应该是单核吧，是属于DAPI弱阳性还是DAPI拒染还真说不清楚；- q) m: g1 U( v7 x
4. ficoll底部应该大部分是红细胞，还有部分粒细胞，红细胞没有核不会被染上，但那部分绿色的确实很奇怪，绝大部分又不是粒细胞，看还有没有哪位高手可以指点一下。
  R/ H; P5 A6 B! a4 i, x, ~