小鼠骨髓密度梯度离心 FCM结果

dyg108

为得到小鼠骨髓单个核细胞，选用ficoll 1.077密度梯度离心。小鼠骨髓细胞以PBS（4 ml）悬浮，ficoll 4 ml，400 g，20 min离心。结束后白膜层明显，PBS悬浮细胞4 ℃过夜后染DAPI，FCM分析，结果如图：
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2013-5-9 13:10 上传

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, V' |1 ?! v2 c& s# G请教，第一张图红色部分是什么细胞？为什么没染上色？
# x$ p7 z) O; r- h5 O2 ^又取来ficoll底部的细胞，DAPI染色，FCM结果如图$ M' c7 V- ^8 ^) v- b- \2 D( ~

2013-5-9 13:14 上传

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3 ~+ i6 K* x/ R3 }5 j/ v5 L这个更是困惑了，请教大虾们

katysong

1. 其实DAPI不是一种严格的区分活死细胞的染料，如果DAPI足量的话，活细胞核也会着色，表现为弱阳性；若是要区分活死细胞，建议可以试一下7-AAD。
0 c' R6 d; k8 r8 M3 r8 h  U  b2. 这次实验DAPI的电压是怎么调整的，怎样确定的阳性和阴性，有没有绝对阴性？' S4 S9 ^+ ~9 A/ Z
3. 002中第一张图，红色部分细胞那么大应该是单核吧，是属于DAPI弱阳性还是DAPI拒染还真说不清楚；. X  O2 {+ \; m5 x) S2 i+ t
4. ficoll底部应该大部分是红细胞，还有部分粒细胞，红细胞没有核不会被染上，但那部分绿色的确实很奇怪，绝大部分又不是粒细胞，看还有没有哪位高手可以指点一下。
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dyg108

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0 x2 r3 r" G8 M; S# I+ a
, O: q0 I' I% _* F3 {. `4 I非常感谢，DAPI电压是以没有DAPI染色的细胞调的。9 }( T( A& \/ g2 k- D( r# r

lyj-0017

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& K. b: o0 d: X! `
' G* F# R6 w6 v* ]8 [3 U      小鼠单个核细胞的分离常用密度为1.092的小鼠淋巴细胞分离液进行分离，而分离人单个核细胞常用密度为1.077的人淋巴细胞分离液。我认为是你用的淋巴细胞分离液的问题，分离液密度不适应，所以分离出的细胞分层也不同。
; l! _) q1 d; n5 K5 X. t% v. J9 l    另外，你小鼠骨髓细胞悬液与ficoll的体积比是1:1，而常用的外周血或者骨髓细胞悬液与ficoll的比例是2:1，也许这也是一个导致细胞分层不正确的一个因素。