小鼠骨髓密度梯度离心 FCM结果

dyg108

为得到小鼠骨髓单个核细胞，选用ficoll 1.077密度梯度离心。小鼠骨髓细胞以PBS（4 ml）悬浮，ficoll 4 ml，400 g，20 min离心。结束后白膜层明显，PBS悬浮细胞4 ℃过夜后染DAPI，FCM分析，结果如图：
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2013-5-9 13:10 上传

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. o7 x. |# L( X6 @0 [; I请教，第一张图红色部分是什么细胞？为什么没染上色？
5 ]6 T6 y$ c9 l1 m  H又取来ficoll底部的细胞，DAPI染色，FCM结果如图; O3 h/ V9 R  L( S# ?- }" Y

2013-5-9 13:14 上传

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9 \9 D2 J7 z  w& r' E; K这个更是困惑了，请教大虾们

katysong

1. 其实DAPI不是一种严格的区分活死细胞的染料，如果DAPI足量的话，活细胞核也会着色，表现为弱阳性；若是要区分活死细胞，建议可以试一下7-AAD。7 t8 E  {9 F7 Q' U1 k; b
2. 这次实验DAPI的电压是怎么调整的，怎样确定的阳性和阴性，有没有绝对阴性？* k; ?  t  p4 o9 O$ h$ v
3. 002中第一张图，红色部分细胞那么大应该是单核吧，是属于DAPI弱阳性还是DAPI拒染还真说不清楚；0 h/ A, K* O. V- `0 r5 T3 f
4. ficoll底部应该大部分是红细胞，还有部分粒细胞，红细胞没有核不会被染上，但那部分绿色的确实很奇怪，绝大部分又不是粒细胞，看还有没有哪位高手可以指点一下。& j6 c3 s$ G8 C9 B3 I3 b

dyg108

回复 katysong 的帖子# _$ g( U+ \) m! H

4 i" p5 a0 N) c2 u' i! q% d* H7 z# X2 p非常感谢，DAPI电压是以没有DAPI染色的细胞调的。
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lyj-0017

回复 dyg108 的帖子' a6 F1 ?) v* J0 v3 G
0 `* b/ B, o7 _2 x# M
      小鼠单个核细胞的分离常用密度为1.092的小鼠淋巴细胞分离液进行分离，而分离人单个核细胞常用密度为1.077的人淋巴细胞分离液。我认为是你用的淋巴细胞分离液的问题，分离液密度不适应，所以分离出的细胞分层也不同。3 x1 T3 B2 E- f1 [, B
    另外，你小鼠骨髓细胞悬液与ficoll的体积比是1:1，而常用的外周血或者骨髓细胞悬液与ficoll的比例是2:1，也许这也是一个导致细胞分层不正确的一个因素。