使用pEGFP-N1构建重组过表达载体问题求助

yangcy-smile

目前，我想把一个ORF约1.3Kb的基因克隆至pEGFP-N1载体中，载体说明中说假如使插入基因与载体自带EGFP标签构成融合蛋白表达，要去掉基因中的终止密码子，现在问题是6 c8 B1 t, K) g5 c6 R6 I
（1）去掉终止密码子的话是不是插入基因会一直通读至EGFP标签至EGFP的终止密码子，那这样的话EGFP与酶切位点之间的序列是否也会被每三个碱基一起被编码成蛋白，从而产生移码突变的问题？
" j. A* c: K! P! w（2）另外在设计引物时，在插入基因的ATG前面是否需要加入Kozak序列？望众位大虾指导

ljzmy82

去掉终止密码子后插入基因会一直通读至EGFP标签至EGFP的终止密码子，并不是有终止密码子就会停止翻译，还必需要有终止序列的帮助，才能终止蛋白质的翻译，另外只要保证插入的序列是3的倍数，是不会发生移码突变的

eley

如果想加Kozak序列的话，那就加上吧，反正我自己做的时候加不加表达都差不多~

yangcy-smile

回复 eley 的帖子
/ R9 [& h7 {' g: \  V3 I* ?' Y# Y" k7 m3 {: m/ J- D
很谢谢您的回答 那在设计载体的时候，把目的基因的终止密码子去掉了吗？考虑移码突变的问题了么？

yueweilei

(1) 想要和GFP形成融合蛋白，需要去掉目的基因的stop codon，需要考虑ORF是否移码的问题。
) z3 x$ P. a; V5 D9 v* N8 z(2) 可以加Kozak sequence

eley

回复 yangcy-smile 的帖子4 s: B+ E2 c3 p3 `& p# W" b
3 l9 D) C1 Y" b: b# N
当然要去掉了，也要考虑移码的

mzaq2006

PEGFP-N1是真核表达载体，一般需要加Kozak sequence。如果要和后面的EGFP融合表达，构建时需要去掉基因的终止密码子，而且要保证基因的最后一个密码子到EGFP的ATG之间是3个倍数。