请各位师兄师姐帮忙，求第一步从全血分离PBMC的方法啊

yuyu600

实验室一直用的采血机采的血，现在突然要做全血分离，跪求第一步全血离心步骤 转速 时间什么的 最好还能分离出血浆 不胜感激

stang198651

回复 luyue6453 的帖子9 [- J$ g# L2 `4 J6 }% L" C0 O- u
( @+ J+ ~9 K. v  P6 v. D) J0 ^9 Y
如果室温解冻析出不完全，那可能是因为温差小，那就水浴解冻，37℃。

luyue6453

回复 stang198651 的帖子
% X! @$ o% }+ Y( J2 V+ S! L
$ O  H5 K8 Z2 y: G" l9 Z嗯，知道了，谢谢您，说的很具体了，我现在也这么做，虽然有部分纤维蛋白析出，当时在培养时还有会有絮状污渍漂浮，而且上面沾满了细胞，似乎细胞都是死的，

sunny.yc

回复 yuyu600 的帖子5 Y/ l3 v7 C  T# l

) M; @* N# ?! B. t) O' G2000转20分钟，下层用DPBS重悬后就可以用淋巴细胞分离液分离出PBMC
- }4 x( L* a' P: t/ H" e6 G上层血浆最好灭活一下再用，如果需要灭活，可以点击回复

stang198651

回复 luyue6453 的帖子, P/ b  g. [9 N7 I: P
9 J$ O4 C) y( R2 Y. B+ Z) s1 G
首先，培养基可以选用无血清培养基，国内外很多公司有很多种无血清培养基供你选择，在无血清培养基里加入一点血清更好。其次，取全血时所用抗凝剂最好是肝素钠，好像商品化的采血袋里都不是肝素钠，这需要你们自己制备肝素钠采血瓶或采血袋，获取的血浆冻存，然后室温解冻，纤维蛋白原就会析出凝固，用吸管吸掉凝固物，再高速离心下就OK了，能再过滤一下就更好，细胞培养的用途下血浆不宜加氯化钙去除纤维蛋白原，因为量不太好把握，一般会加足量氯化钙，那么在血浆加入到培养基之后培养基之中就增加了钙离子浓度和氯离子浓度，影响细胞生长。

luyue6453

回复 stang198651 的帖子
3 g: x$ _' D' P! n* j: d7 y6 `9 z( t, F* ~3 F
你的回复解决了一直困扰我的问题，太感谢了，还有一个问题想请教，培养CIK 不加血清生长很慢，当时血清量很少，不够用，有没有什么好的办法或者用什么培养基，来克服这个问题，让细胞稳定生长，再一个问题就是怎么去掉血浆中的纤维蛋白原呢？因为取全血的时候一定要加抗凝剂的。

stang198651

      如果血液是加了抗凝剂的，那么离心获取的不是血清，而是血浆了。血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。血浆是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，其中含有纤维蛋白原（纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用），若向血浆中加入钙离子，血浆会发生再凝固，因此血浆中不含游离的钙离子。
3 s  ]3 f/ W. c! p0 ]9 W      血浆如果不经过处理，去除纤维蛋白原，那么在加入到培养基之后会发生凝固，培养基会变成凝胶状（本人遇到过），因为培养基里有钙离子。抗凝剂如果是用枸橼酸钠，那么血浆中的枸橼酸钠一般是超标的，加入到培养基之后，还会结合培养基之中的钙离子，造成培养基之中钙离子浓度减少，进而影响细胞生长。所以得注意额！

meixue1130

这一步我们实验室的经验是将全血转到离心管中，每管量不要装得太多，50ml离心管装30-35ml全血比较好，配平离心2000rpm,5-8分钟，分离出的血浆挺多的。

chslyx

我们现在全血3000r(1750G)离8min，血浆也是同样的转速时间，效果挺好的

lyj-0017

回复 yuyu600 的帖子
" r2 B. l/ ?; ?: R& V$ r1 B
7 w' l4 ~. i7 u: L; f$ W全血加入离心管中，于1500-2000rpm离心10分钟，离心后的血浆再于3000rpm离心10分钟可获得血清，很简单。
5 p5 v# q' @9 l* p8 ^7 U另外想问一下，你们为什么不用采血机采富集血而改用全血分离呢？