细胞冻存问题

jin492

我用90%FBS+10%DMSO、70%DMEM+20%FBS+10%DMSO、专用干细胞冻存液3种方法冻存hES,均告失败，看了很多文献也未找到原因是什么？郁闷哪！
+ X& j( r3 y3 }5 a* u9 e7 E; B我冻存别的细胞还真从未失败过，问题到底在哪儿呢？请教！

星光灿烂

hES是要以团块的形式冻存，你是不是把团块吹成单细胞了

jin492

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( N2 T* J( Y; X; h3 ?" ?- ]  C
# o, S, W9 r# l$ }我是以团块形式冷冻的呀，团块大小类似于传代时的大小

星光灿烂

复苏的时候，先用ES培养基稀释10倍再离心，接的时候也不要怎么吹打，还是有很多细节需要注意的

星光灿烂

还有你离心的转数之类的，你不说一下具体的细节，我也不知道你什么地方出问题了，我也是新手咱们可以一起讨论

星光灿烂

冻存的时候不用吹成传代的大小，是以大团快冻存的，消化下来不用怎么吹打

sun_happone

应该不是冻存液的问题吧，看看是不是消化、冻存、复苏的方法不对呢？

franklinhg

冻存ES 有标准的protocol 一般严格按照SOP操作 不会出问题。 新人的最大问题就是好奇心强，什么都想尝试看看结果会怎么样（自己曾经也是）。

qiushuiwuhen

建议考虑下酶法消化，用Dispase酶，性能比较温和（我说的feeder-free的HES），最好保证克隆的团块比较大，要比传代时的块大很多，另外就是离心机转速文献里面写的是200g(转换之后应该是600多rmp/min)，最后就是吹的时候一定要特别轻，HES复苏本身就对细胞损害很大，所以要耐心

20111109

为什么我用的冻存液是70% FBS＋20% 培养液＋10% DMSO。。。。