如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；1 J, Z' v( p3 e% z% {- z
2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；
% ~- @0 C7 w6 ~2 W3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；
9 a% H1 Q5 k: I4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；
3 S4 O6 E$ x% R1 N% Z* O' @5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
1 y& x3 A0 U# u9 l6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。
' W4 m( z% r! \8 z# K2 X7 z7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。5 n& y0 I1 v! E; I& C  U, c( ]
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（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）
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妖妖空

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那个就是我说的FRET方法，方法很成熟，你可以到springer找下它的protocol。

妖妖空

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: N! w) b' k/ ]  n( w5 V$ B: D! k1 `这个我也不是很清楚的，都是实验室的技术员在做这些东西，我们只看最后的结果，自己的最后观察时用的是430nm激光激发GFP，受体的YFP接受CFP激发转移的能量，能看到530nm的荧光。