如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议
8 N" }0 B% j' _% v
4 H: q4 D% D8 P; h4 D自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内& ], d$ Q0 x, ^* I( J6 Z7 X/ P

: W! T: f+ l3 `+ ?% {6 v% `6 r! p问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。
. ]  N& k, s- R8 d( r  K8 C- n: i
9 V. q& }) @5 L, C; j拟解决方法：  
" S% G& `  D+ P, ~" [% h+ w; g4 u方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。; G- W1 v: L" P9 {9 g- w- l
方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   + N3 K' I$ u: S. M& j6 e
               写着 发现有点牵强···）
" x6 v& Q1 [- u, z4 y8 d" a6 n2 G* K- j2 N方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···1 |, K' h4 V+ C4 T, K/ s& G# {
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: |" K- \7 s, @- M" \

; i, X/ f) L  w5 m恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

小兔子lp

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

daiying5200000

建议用荧光共振能量转移。

寒山拾得

IF & 提核蛋白WB

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；
, e1 q6 m9 F3 x+ f7 _8 K/ B$ h2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；
2 Y# H$ y3 |6 @" I1 M0 @! D2 V3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；9 B) W' G, x4 J* s1 s$ a4 s
4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；7 A9 c# T0 Y: [' U6 @/ \1 t
5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
) v" w" n) `4 S$ \7 e5 b  T6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。$ S9 T8 ?! o, w3 Q$ z$ G6 D
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。  q: I, K( `' ~' K( f- x
; p+ h! r. K4 _! |9 n
（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）
0 e/ Q+ A' f6 s* C$ \# S0 `3 C

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子! [8 f4 o# O/ e. \
) v+ i' `# [5 h0 ?
首先谢谢你们的意见和建议；
! n# |7 H' w( c% |) e! v, J5 _1 `
* {: j! }. ?. N! o6 q/ C' x+ [! @自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；2 _4 P" v6 P; c) F; ^
构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。
1 q2 f- C4 K! z) W蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；& p7 Q% u5 B* W: N9 K' ~9 o# Z) u

4 c) ^2 b8 i' s: u& Z4 w( _' d还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！( ?, N7 E5 L. _3 ?% s
对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  4 a: C" W- K4 e- K0 W3 ^! t& X# j( j

& q) V7 f1 }; w/ ^各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

4 O/ W/ D2 X; q: E, S. {6 i, T0 \$ r% r$ v  {7 a
回复 小兔子lp 的帖子, ~$ {0 M: O0 B% _

2 J8 v- t. d5 G/ q. F' E, i; Q) O可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

回复 寒山拾得 的帖子
5 E# C1 i2 l; Q, m+ @  L6 J( e: Z
0 \% v: ?  z* U% g' `* x9 S: [问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。& P+ _9 J' }5 ]# j

$ L) V$ V6 {% l6 t因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？
6 Z$ F3 j+ L# I6 q1 {6 j8 G0 e
4 f* r) e# V3 z1 ]* }5 ?$ D" V; d如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子; D8 N8 ^7 D$ q( A( \  N- I; F+ a

5 D, `8 y5 s6 w! [$ T一个完全陌生的专业词汇···