如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

Andyhigh

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？ 希望各位战友给出宝贵意见和建议- f/ R( W3 u  Y2 D/ `  v

  d3 s; q; G0 W/ ^自己的思路： 用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位； 将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内
1 L. @6 H! L- `* s  b% c7 b& t: i5 F
3 P! ^1 h2 K+ b  `7 l. j; }; f问题： 细胞是立体的结构，细胞核的上下 前后及 细胞核里面 都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白 和 细胞核 里面的蛋白可能造成 混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。( w. X# }' E: W# d$ T
; U# G- Z% ~. |$ f: X$ p$ V
拟解决方法：  0 {8 V  w( ]7 @1 f2 X$ I. _
方案1  ：用激光共聚胶 显微镜 拍摄 立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜 拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。
3 V; g/ {( {- T. D. A9 w4 R方案2 ： 试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核 的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（   7 }/ W; j; c/ |( X. \* b. b! H
               写着 发现有点牵强···）
: B$ Y3 j; I# W( C( B  r& P5 }6 K方案3： 老板说试着用 原味杂交 的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···4 ?( q* E+ a: \1 U
+ V  K( @* g9 g- U) s* x9 J
" K6 Y% ^- D$ H0 }# |6 i5 G/ h

: _0 X! z$ Z# A2 x2 T# p( @恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

Andyhigh

自己顶一个···

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子$ X8 B8 d' |, Z& W

  K2 ?3 h# G" ~7 n2 j首先谢谢你们的意见和建议；
7 ^/ e% {: \+ w0 X+ J/ y  `" N' S8 S4 L6 `+ e% X
自己做的是 用蛋白诱导iPSCs；0 R  D* l$ t, R9 E$ @
构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。+ J& Z+ r5 o) o0 c+ ]+ q
蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。 但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内 说的比较模糊；/ F* \# a* B, b7 i' i0 C

! V" B  H& ~7 t4 _还希望 妖妖空 能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！
6 s. x& W$ E: p2 N对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  . n- Z  g( r- _7 S( k. }0 h

: f" G2 @. @& T3 a, P各位可有原位杂交的protocol？？？

Andyhigh

" L2 h) Z, m7 l* H* v, e

" T5 `9 r0 U  j回复 小兔子lp 的帖子
0 @+ _: h; y) [* `+ I3 e, O
% k+ G; c' `0 E可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

Andyhigh

回复 寒山拾得 的帖子2 Q# S5 Y( j9 J) y
4 G# ~' U9 F7 Y; ~6 q7 U
问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。
& V: U) r! U$ f$ `' n, }' b# a
. P9 Z4 }, _& k& B因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？
% h2 T% y: v( \6 _* _: R7 {( t3 z1 c3 ~1 p
如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
7 s. z, v% Y5 ?' D5 \3 _1 ^+ ?3 \2 k, }/ I( o
一个完全陌生的专业词汇···

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
- F. ]1 Y+ |( Y1 z, I2 ?- {
: G7 S! u9 z! z0 N0 W: t很想找到 “ 至于普通的荧光染色，用DAPI等染色，甚至是共聚焦，效果不是很好的，没够足够的说服力，不过用细胞骨架定位或许可以。之前有好几篇文章都提到这点，有两篇文章甚至是一个失败的例子来说明这些问题”   和  "这点在KIM的一篇CELL上有提到过，他也举出了他们失败的例子，就是C端和N端的问题''   这几篇文章，  尝试了下 没有找到

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
  e2 G4 X/ u$ v: F3 Y$ N" T/ x, k  h; a1 ?) J2 q3 v
真的很感谢  ，虽说第一篇已经有了， 干细胞之家 真是个好论坛！！！

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子3 K0 C; |) b5 z9 m; g! o5 t: s' E( M3 M9 d

) q( y  Q4 _( s$ e& I按照你的方法，我也找到了FRET的相关资料； 不过我还有个疑问，就是FRET技术需要哪些 仪器 和 试剂 ？？？  我们实验室有 倒置的荧光显微镜（奥林巴斯的），学校有激光共聚胶显微镜。 所需试剂及牌子我也不是很清楚， 希望 妖妖空 能为我解答下，谢了啊！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
) O. H1 ]( ]0 y
2 W: ?* d$ b3 p/ y9 P! [你给我的这几篇文章，帮助挺大的；自己在这基础上，又找到了一篇Cooke组的另一篇文章 《Activation of Innate Immunity Is Required for Efficient Nuclear Reprogramming》--2012年
2 R- c2 c& r5 [" c8 R; ?
* l- |/ B# y! O( Z  C9 v5 }; E 不过我还有个疑问，就是FRET技术需要哪些 仪器 和 试剂 ？？？  我们实验室有 倒置的荧光显微镜（奥林巴斯的），学校有激光共聚胶显微镜。 所需试剂及牌子我也不是很清楚， 希望 宁能为我解答下，谢了！！！