如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

daiying5200000

关于楼主所做的实验：重组蛋白诱导IPSC。最重要的一点，蛋白必须进入细胞核，蛋白必须与目的DNA结合，促进OCT4，SOX2等的高表达。这个就是原理。6 }% P: {! A+ S! q& m+ G
那么仅仅是蛋白质通过穿膜肽进入细胞核是不够的，是没有说服力的，因为你的蛋白可能没有作用，可能会降解。所以用荧光能量共转移可以显示这点。就是一个荧光素比较你的DNA序列，另外一个标记你的目的蛋白，如果他们紧密结合将产生共转移，可以通过仪器显示出来。
! |/ D2 n: ?* ?6 J1 T至于普通的荧光染色，用DAPI等染色，甚至是共聚焦，效果不是很好的，没够足够的说服力，不过用细胞骨架定位或许可以。之前有好几篇文章都提到这点，有两篇文章甚至是一个失败的例子来说明这些问题，只是现在我这些文章找不到了。
- i7 \' M! t. E; [' Y2 A另外，有如下方法可用：6 T3 x' K) k4 A% U
用量子点的标记方法，通过去卷积显微镜观察也是可以看到的，只是比较麻烦。
8 R; O8 D  e8 o  L6 ^1 d用纳米包被蛋白与荧光素也是可以的，当然必须有成熟的纳米技术和你合作，这个很好发文章。
3 ^" g9 P! T" L% N我们曾经和光电物理学院合作，构建过细胞的三维图像，在他们那里高倍数的显微镜下可以检测到细胞内部分子成分的变化和位置，但是对实验的场地要求很严格，光电学院是没有培养室的，呵呵。
, L* d) d7 W& Z还有一点，你的蛋白构建的穿膜肽是加在蛋白的C端和N端情况不一样的，而且各种蛋白都不一样，所以你诱导成功的几率也不是很大，看你运气了。这点在KIM的一篇CELL上有提到过，他也举出了他们失败的例子，就是C端和N端的问题。( q  S" k6 w& A" G* i
我们实验室以上方法都有尝试，共转移的方法用的多，效果不错。去卷积也用过，效果一般般，但是图片漂亮，放到文章里面感觉饱满，呵呵。
- g6 c5 r. _4 U  O! s- E9 z祝你好运！

小兔子lp

回复 Andyhigh 的帖子  z! F) g, N' n! N1 D, d0 @5 j+ t, G

. X+ o% p; ?* Z! @' Q- o0 D我手边没有现成的protocol，但很多文章中都用了这个方法，你可以查一下~

小兔子lp

Andyhigh 发表于 2013-7-30 21:10 9 z) u7 C( F- c- u6 O' p. M
回复 小兔子lp 的帖子3 w# {' ]3 c0 X  E! E9 r0 k" f
: R8 Y2 d) Q0 z
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

" P2 Z+ J& J+ N3 E, o
手边没有现成的protocol, 但很多文章中都用了这个方法，可以查一下~

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子8 x* j1 |3 n$ T( }8 E0 d1 ?/ r
4 E' A! i: \* D4 ~2 W0 l* U' o
很想找到 “ 至于普通的荧光染色，用DAPI等染色，甚至是共聚焦，效果不是很好的，没够足够的说服力，不过用细胞骨架定位或许可以。之前有好几篇文章都提到这点，有两篇文章甚至是一个失败的例子来说明这些问题”   和  "这点在KIM的一篇CELL上有提到过，他也举出了他们失败的例子，就是C端和N端的问题''   这几篇文章，  尝试了下 没有找到

daiying5200000

回复 Andyhigh 的帖子
# T3 ]4 D" i. |. f4 H( P( J2 w: b5 |
很可惜，我也找不到了。找了几篇其中有失败的总结。以及蛋白质在细胞内的检测。

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
# `+ a# R1 H) h* G' }7 ~- W9 q; f$ `
真的很感谢  ，虽说第一篇已经有了， 干细胞之家 真是个好论坛！！！

妖妖空

回复 Andyhigh 的帖子: k& p$ o$ n0 Y3 l
$ _: M( h. E0 i: a* k
那个就是我说的FRET方法，方法很成熟，你可以到springer找下它的protocol。

Andyhigh

回复 妖妖空 的帖子
/ R. t$ ~  v7 T9 O3 u0 ~
) {: j7 B% Z6 N" |) O# [/ O按照你的方法，我也找到了FRET的相关资料； 不过我还有个疑问，就是FRET技术需要哪些 仪器 和 试剂 ？？？  我们实验室有 倒置的荧光显微镜（奥林巴斯的），学校有激光共聚胶显微镜。 所需试剂及牌子我也不是很清楚， 希望 妖妖空 能为我解答下，谢了啊！！！

Andyhigh

回复 daiying5200000 的帖子
9 j. g4 m; J" w7 n, y" I" ]- {0 L6 k
你给我的这几篇文章，帮助挺大的；自己在这基础上，又找到了一篇Cooke组的另一篇文章 《Activation of Innate Immunity Is Required for Efficient Nuclear Reprogramming》--2012年
9 Z; s7 N& \7 M: k* ~4 i0 u6 P
不过我还有个疑问，就是FRET技术需要哪些 仪器 和 试剂 ？？？  我们实验室有 倒置的荧光显微镜（奥林巴斯的），学校有激光共聚胶显微镜。 所需试剂及牌子我也不是很清楚， 希望 宁能为我解答下，谢了！！！

daiying5200000

! R% l! h  m9 M* \! i
) g, e- e, f$ K0 j0 N! R回复 Andyhigh 的帖子
# B- X0 J9 W9 f* f  y" ?6 j5 }' f6 G9 F. Q- m4 ]. e# d0 M
我今年已经毕业了，具体的记录都没带出学校。是有个试剂盒与特定的仪器，一般都会有方法说明的。由于我们实验室以前经常做基因工程药物，要测定蛋白是否进入细胞而且定位在哪里，有没有作用所以才有这个技术。我们都是实验员做的。所以我也记不清了，不好意思。如果共聚焦可以的话，是比较快捷的方法，共聚焦也是可以构建三维的，技术员一般都会的，只要你双染就可以分辨。我师弟师妹做过共聚焦的，细胞染色三维立体图，还不错。