如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

妖妖空

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；/ a% O$ c2 c1 c$ [, T
2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；
- t0 G# b% R: ^6 S' K  i3 ^# b) C3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；
- [! I: g2 i$ x8 [* h! j4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；1 A. ~" N, w* a7 j2 w& y8 }1 @
5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。
% {! s: ~& R$ V6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。% q7 x1 L" K3 J) v
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。3 ^" C: V; Q/ g: A1 Z5 ^5 v* P
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（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）" T3 ~, m; p& u4 o! z8 b, M

妖妖空

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- o3 C6 s( J8 n1 f6 |* K0 U那个就是我说的FRET方法，方法很成熟，你可以到springer找下它的protocol。

妖妖空

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, G/ {" z1 a, X* y这个我也不是很清楚的，都是实验室的技术员在做这些东西，我们只看最后的结果，自己的最后观察时用的是430nm激光激发GFP，受体的YFP接受CFP激发转移的能量，能看到530nm的荧光。