细胞消化问题

heming

请问在用胰酶消化细胞时，对于贴壁能力不是很强的细胞（如293T这一类的细胞）消化时很快就脱壁了，但是细胞之间的连接很紧密，传代完显微镜观察看到很多都是几个细胞成团的小块，容易造成局部聚集。消化时间延长一点又导致传代后细胞状态不是很好，漂浮细胞会很多，请问这种情况一般怎么解决啊？除了选择一个合适的消化时间还有其他的办法吗？ 谢谢

luyoude

之前养293都是不用胰酶消化的，就直接吹打！

moonison

第一不要消化时间太久，实际上293T不消化也可以的，消化太久对细胞状态有影响，当然和你们实验室具体的细胞，甚至某代细胞都有关系，具体条件要慢慢摸索，显微镜下看是比较仔细的做法，第二一定要吹打，293T是很皮实的细胞系，可以好好吹打，甚至直接用枪头吹打，比如用1ml的枪头，然后不放心的话可以去显微镜下看下是否还有关联，然后再继续下面的操作。离心之类的。

漂泊的风

降低胰酶的浓度会好点，你可以试试

starlancer

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7 [8 j) F6 z4 D出现这个情况，首先是因为你的细胞培养状态很可能过于密集了，比如说293T细胞，不要长到100%confluent的时候才传代，细胞过密后回影响细胞的健康状态，然后就是处理时间，要自己摸索一个opitmal 时间，这个因为不同的人手法不同，所以要自己摸索，第三个就是不要过分的吹打。所以总结下来，首先细胞不要太密，等到80-90%confluent的时候传代，然后摸索最佳trypsin消化条件，找到细胞detach而且也没有多少cluster的时间，最后轻轻吹打几次使cluster分散，均匀的铺板。

cn8867567

这个是我看到别人的经验，分享给你吧！不过我觉得这个有点过于纠结了。; p4 n. e7 C) j; F

1 p, t: Q& u  u" W    在消化的过程中，你加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是我们忽视了一个问题就是，细胞的生长状态是不一样的，每一个细胞的贴壁情况也是不一样的，有的贴壁牢固，有的贴壁没有那么牢固的，所以，让所有的细胞消化同样的时间对细胞是不公平的，他们受到了差别待遇当然会有脾气啊。。。呵呵。我后来对消化的方法进行了改良。争取做到因材施教呵呵。我称之为“四步消化法”。（以难消化细胞为例）
* [5 y* _5 o  Y具体操作：
& q: [9 s* @' `( t3 V! b1）.首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗1-2遍，（这是前奏，即为第一步，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。
3 ?; b1 s3 w! v9 F/ y2）.然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。即为第二步（你可以将这些传入新瓶培养，以与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度了。）
' o  M6 |, ~6 r5 m, G' R7 r9 v4 D  }3）.吸干净瓶内剩余液体，加入0.3ml左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净子弹头里备用，加入新培养基开始吹打，吹打2-3遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用2ml左右新培养基洗一遍与前面的混合。（你也可以传入新瓶培养，以与后面及前面的做对比。）这是第三步。/ p! Z2 b  b2 }
4）.然后把前面刚吸出来的胰酶重新加进去瓶里继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。当然你也可以用新的胰酶，如果你们那比较富裕的话，呵呵。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新瓶培养（根据实际情况你自己把握）。这是第四步。9 B, T: f- t3 L3 H8 s9 R0 s/ y
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其实还可以有第五步，对于特别难消化的细胞和对胰酶特别敏感的细胞的话，你可以继续加第五步甚至第六步。为了细胞更好的状态，更漂亮的样子，没办法，你必须分多批多次消化，这样才能最大限度地将胰酶对细胞的损伤降到最低，保证细胞的状态能够最优。
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当然了，如果细胞是属于那种很容易消化的细胞，像RAW264.7，仅仅第二步就搞定了。就没必要第三步第四步了。这个是需要你在实验中能够自己用心去体会的。建议你接受一个新细胞时把各步消化的细胞分别培养起来做比较，去摸索好细胞对胰酶的要求。便于你后续实验的开展。- k5 g* d" N- k1 [

cn8867567

这个是我看到别人的经验，分享给你吧！不过我觉得这个有点过于纠结了。. N- f- Z5 N5 @. h, m5 f
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    在消化的过程中，你加入胰酶后，所有细胞都在被胰酶消化着，但是我们忽视了一个问题就是，细胞的生长状态是不一样的，每一个细胞的贴壁情况也是不一样的，有的贴壁牢固，有的贴壁没有那么牢固的，所以，让所有的细胞消化同样的时间对细胞是不公平的，他们受到了差别待遇当然会有脾气啊。。。呵呵。我后来对消化的方法进行了改良。争取做到因材施教呵呵。我称之为“四步消化法”。（以难消化细胞为例）
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1）.首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗1-2遍，（这是前奏，即为第一步，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。
% j( S8 n- S$ @- O2）.然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。即为第二步（你可以将这些传入新瓶培养，以与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度了。）6 D9 F; b2 I: c, ?9 j
3）.吸干净瓶内剩余液体，加入0.3ml左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净子弹头里备用，加入新培养基开始吹打，吹打2-3遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用2ml左右新培养基洗一遍与前面的混合。（你也可以传入新瓶培养，以与后面及前面的做对比。）这是第三步。
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3 D# R. [! s2 H2 ]$ b0 }4 a$ N( N9 G! t  T其实还可以有第五步，对于特别难消化的细胞和对胰酶特别敏感的细胞的话，你可以继续加第五步甚至第六步。为了细胞更好的状态，更漂亮的样子，没办法，你必须分多批多次消化，这样才能最大限度地将胰酶对细胞的损伤降到最低，保证细胞的状态能够最优。
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当然了，如果细胞是属于那种很容易消化的细胞，像RAW264.7，仅仅第二步就搞定了。就没必要第三步第四步了。这个是需要你在实验中能够自己用心去体会的。建议你接受一个新细胞时把各步消化的细胞分别培养起来做比较，去摸索好细胞对胰酶的要求。便于你后续实验的开展。
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heming

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  M! a" y/ D+ C8 X9 X9 q( ^8 l; f" p$ E. S. Z  Z" @+ [: O
谢谢

ymt312

贴壁细胞的消化时间非常重要，根据文献数据再加上自己的摸索最终确定消化时间。我认为在显微镜下观察消化时的细胞状态，从贴壁细胞变成小圆球状，停止消化。吸管反复吹打，使细胞散开。我个人觉得细胞没有那么脆弱，反复吹打不会对细胞有破坏，所以放心吹打，这样就不会连在一起了。

20111109

PBS洗完细胞以后，加入胰酶，显微镜下观察（细胞形态本来是贴壁的张开式，渐渐的从张开式缩成小圆球状），当然也有一些细胞类型是成片的下来的（比如SSC培养过程中的MEF总是被成片的消化下来），这种情况下，只能靠加入终止液后吹打来实现细胞的分散。我在实践过程中还发现了一个小窍门：就是在终止后收集到离心管中离心1次后，弃掉上清，再悬浮，吹打（这里一定要吹打），离心~~（不过，多离心一次会损失掉一部分的细胞）但是，这样传代的细胞是很好的。