请教人胚胎干细胞冷冻解冻问题

qiushuiwuhen

各位战友，想请教关于胚胎干细胞冷冻的相关问题，我目前的情况是：在使用有饲养层的情况下，用IV胶原酶（1mg/ml）消化干细胞10min，然后中和HES培养基，用枪轻轻吹打，最大限度保留肝细胞团块的完整性，然后用干细胞培养基：FBS：DMSO=8:2:1的比例冷冻液进行冷冻放进程序性冷冻盒中，放进 -80冰箱，第二天放进液氮中；在养feeder-free的人干细胞的时候用dispase酶(1mg/ml)消化半小时后流程同上；
* {) j& r' _/ r/ z" [6 `: x现在的问题是每次解冻上述两种模式的干细胞时，细胞的状态都是无比之差，多数时候都养不起来，想请教各位战友：1、针对上述两种情况，你们实用的冷冻液的配方是什么，冷冻时需要注意什么，比如操作的细节；2：解冻的时候有没有什么注意的；3：像我上面写的干细胞培养基中，BFGF的浓度有没有要求（我是10ng/ml),谢谢指导

郁金凤

90%的FBS加10%的DMSO  我们实验室基本上解冻细胞存活率达80%，不过还是与个人操作过程有很大关系

细胞海洋

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7 k! V8 t% d$ ?你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样
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否则他会看不到

qiushuiwuhen

感谢上面几位胞友的详细指导，那你们解冻的流程怎样呢，解冻效率高吗，有没有什么诀窍，谢谢不吝指教

mtdj1314

IV胶原酶（1mg/ml）在37度预热，消化20~30min，效果还可以，这是有feeder的。干细胞团块吹打到传代大小，冻存体系可以再把FBS加大一成试试~

heming

自己觉得一个比较好的冻存液配方，FBS 90%  DMSO5%  细胞5%  

千细胞

就9成的FBS加1成的DMSO;' _( [% {1 y6 g5 F4 _

sleevexz

FBS 多加一些，可达50-90%, 20%的DMSO要预先冷藏，然后与细胞悬液1:1混合

qiushuiwuhen

http://www.biomart.cn/experiment/430/488/490/495/30778.htm自己顶下

qiushuiwuhen

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0 q3 o) E4 B. U7 u- ?' Y请教您的详细指导